大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理
大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。用純化的大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α（TNF-α），再與HRP標(biāo)記的腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α（TNF-α）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）濃度。

操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
360ng/L 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
180ng/L 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
90ng/L 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
45ng/L 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
22.5ng/L 1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5. 洗滌：大鼠腫瘤壞死因子α小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。 
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。