雙歧桿菌屬放線菌科雙歧桿菌屬,革蘭氏陽性桿菌,G+C%含量高,專性厭氧。在健康人體腸道內(nèi)存在的多種細菌中,以雙歧桿菌發(fā)揮的生理功能zui為重要。該菌在維護腸道菌群平衡、抑制病原菌生長、抗衰老、抗腫瘤以及為人體提供多種營養(yǎng)素等方面發(fā)揮了作用。
　　
　　雙歧桿菌能通過合成乳酸和乙酸等物質(zhì)調(diào)節(jié)腸道pH值,并依靠自身的黏附能力抑制外侵的多種腸道致病菌和條件致病菌的侵襲,預(yù)防和治療胃腸炎、結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎以及慢性腸道感染等多種胃腸道疾病。然而,目前報道中關(guān)于雙歧桿菌與腸道細胞相互作用的研究很少,尤其是雙歧桿菌在腸道環(huán)境中的適應(yīng)性機制的研究尚無報道。本研究中所用的長雙歧桿菌NCC2705分離自健康嬰兒的糞便,是與人體相關(guān)的雙歧桿菌中十分重要的一個菌株。
　　
　　瑞士雀巢公司的研究人員于2002年完成了該菌的基因組測序,使其成為*個遺傳背景清楚的雙歧桿菌,便于功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。為研究長雙歧桿菌NCC2705在腸道內(nèi)的適應(yīng)性機制,我們利用家兔作為動物模型,將分別在家兔結(jié)腸內(nèi)和家兔體外培養(yǎng)的長雙歧桿菌NCC2705進行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。利用雙向凝膠電泳分離蛋白,并用ImageMaster2DElitePlatnum軟件對電泳結(jié)果進行分析。研究發(fā)現(xiàn),在經(jīng)過家兔體內(nèi)培養(yǎng)后,長雙歧桿菌NCC2705的全基因組蛋白中共有38個蛋白點表達豐度發(fā)生了3倍以上的變化,同時有4對蛋白點在膠圖上發(fā)生了位置的遷移,可能是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的結(jié)果。此后,我們對這38個表達差異的蛋白點及位移的蛋白點,用MALDI-TOF-MS和/或ESI-MS/MS進行質(zhì)譜鑒定,并利用半定量RT-PCR進行了驗證。結(jié)果表明,該38個蛋白點代表了33種蛋白,與體外培養(yǎng)相比,體內(nèi)培養(yǎng)的長雙歧桿菌有19個蛋白上調(diào),14個蛋白下調(diào),4個蛋白發(fā)生了位置遷移。這些差異蛋白包括應(yīng)激蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白以及翻譯相關(guān)蛋白等。我們對一些與長雙歧桿菌NCC2705腸道適應(yīng)性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白進行了分析:在體內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng),膽鹽水解酶比在體外培養(yǎng)表達豐度提高了5.2倍。膽鹽水解酶能催化水解甘氨酸和牛磺酸共軛結(jié)合膽鹽,釋放氨基酸并使膽鹽失活形成膽酸,使益生菌避免了膽鹽的毒害作用。該酶在益生菌與體內(nèi)環(huán)境交互作用的初期,以及在機體腸道對游離氨基酸的利用和腸道抗膽鹽毒害的過程中發(fā)揮了重要作用。延伸因子EF-Tu在體內(nèi)培養(yǎng)后,表達豐度增加超過5倍。它是一種新型表面蛋白,主要在蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮作用,具有黏附因子的特征并誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)。
　　
　　其它體內(nèi)培養(yǎng)過程中的上調(diào)說明該蛋白在細菌的定植和黏附過程中發(fā)揮了作用。此外,應(yīng)激蛋白包括:與蛋白折疊、聚集和降解相關(guān)的應(yīng)激蛋白（GroEL）,觸發(fā)因子的伴侶分子（Tig）和ATP依賴的Clp蛋白酶水解亞單位2蛋白（ClpP2）,它們在家兔體內(nèi)培養(yǎng)后表達豐度均明顯增加,主要作用在于避免長雙歧桿菌受腸道內(nèi)各種有害因素的影響,得以在腸道內(nèi)苛刻的條件下存活。雙歧桿菌寄居于胃腸道,是通過其*的BifidShunt途徑進行糖酵解的。在本研究中,該途徑的相關(guān)酶中有3個酶在雙歧桿菌經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)后表達豐度升高,它們分別是醛糖轉(zhuǎn)移酶、酮糖移轉(zhuǎn)酶和核糖5-磷酸異構(gòu)酶,這表明長雙歧桿菌NCC2705充分利用了這些酶快速生長來參與腸道內(nèi)的菌群競爭。本研究中位置發(fā)生遷移的4個蛋白分別是:GlnA1、PurC、LuxS和Pgk,進一步利用Pro-QDiamond磷酸化蛋白膠染色和WesternBlot的方法,對遷移蛋白點的磷酸化修飾進行了驗證和分析。結(jié)果顯示,Pgk和LuxS兩個蛋白發(fā)生了磷酸化作用。長雙歧桿菌NCC2705中的Pgk被磷酸化并形成磷酸化中間體發(fā)揮作用;LuxS是密度感應(yīng)系統(tǒng)中信號分子AI-2產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵酶,該蛋白在體內(nèi)環(huán)境中磷酸化修飾作用增強。我們推測磷酸化形式可能是LuxS的一種活性形式,即LuxS-P,該酶以這種形式在雙歧桿菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。通過前面蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,我們發(fā)現(xiàn)了一些在雙歧桿菌適應(yīng)腸道環(huán)境過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用的蛋白,這些蛋白增強了雙歧桿菌對周圍不利環(huán)境的適應(yīng)能力。此外,我們還發(fā)現(xiàn)四個位置發(fā)生遷移的蛋白,其中與細菌種間交流信號分子AI-2的產(chǎn)生密切相關(guān)的LuxS蛋白發(fā)生了磷酸化,這一現(xiàn)象表明其在雙歧桿菌適應(yīng)腸道環(huán)境、與其它菌群進行信息交流過程中可能發(fā)揮作用。因此,我們針對長雙歧桿菌NCC2705中LuxS蛋白是否具有功能,該菌是否能分泌具有活性的信號分子AI-2進行了研究。我們利用對AI-2特異的哈氏弧菌BB170報告系統(tǒng)檢測長雙歧桿菌NCC2705和LuxS過表達菌中AI-2的分泌及活性。實驗發(fā)現(xiàn),長雙歧桿菌NCC2705的luxS基因能在大腸桿菌中表達。通過對長雙歧桿菌NCC2705和LuxS過表達重組菌中的AI-2進行檢測,發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌NCC2705和重組菌均能分泌信號分子AI-2使哈氏弧菌BB170發(fā)出熒光,且AI-2的分泌量在一定范圍內(nèi)與雙歧桿菌菌群密度呈正相關(guān)。這一結(jié)果表明,長雙歧桿菌NCC2705中LuxS蛋白具有活性,并存在依賴于luxS/AI-2的QS系統(tǒng),能夠分泌群體感應(yīng)信號分子AI-2。本研究詮釋了長雙歧桿菌NCC2705在腸道中的適應(yīng)性機制,利用家兔作為腸道模型研究雙歧桿菌在腸道內(nèi)的生理性變化,并結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化染色等方法對該菌在機體內(nèi)、外條件下的蛋白表達變化進行了有效比較。此外,本研究對長雙歧桿菌NCC2705的群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子AI-2的存在以及其產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵酶LuxS的功能活性進行了研究和驗證。
　　
　　長雙歧桿菌NCC2705腸道適應(yīng)性機制研究