河豚毒素的檢驗(yàn)

摘要  本文介紹了河豚毒素的發(fā)現(xiàn)，研究現(xiàn)狀，毒理作用，中毒癥狀以及反向液色譜法，反向離子對(duì)液相色譜法，毛細(xì)管區(qū)帶電泳法三種重要的檢測方法。

關(guān)鍵詞  毒理作用；中毒癥狀；反向液相色譜法；反向離子對(duì)液相色譜法，毛細(xì)管帶電泳法

0  簡介

河豚毒素系日本學(xué)者田原良純1909年首先從河豚魚中發(fā)現(xiàn),并定名Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ。1950～1957年,橫尾晃、津田藤介等人首先從紅鰭東方魚屯,紫色東方魚屯卵巢中獨(dú)立地分離到了結(jié)晶態(tài)的河豚毒素。ＴＴＸ主要存在于河豚魚類體內(nèi),人們?cè)日J(rèn)為ＴＴＸ是河豚魚本身的代謝產(chǎn)物或基因產(chǎn)物,但逐漸發(fā)現(xiàn)許多其它海生、河生動(dòng)物如某些蟾蜍、蠑螈、藍(lán)環(huán)章魚等也含有此種毒素,就使這一想法不攻自破。近年來的研究成果表明,ＴＴＸ由細(xì)菌產(chǎn)生,經(jīng)食物鏈作用傳遞到動(dòng)物體內(nèi)。ＴＴＸ在生物體內(nèi)一般以微量形式存在,近年來,生物工程技術(shù)在海洋生物毒素研究上的應(yīng)用為獲取和制備生物毒素提供了一個(gè)簡潔可行的途徑,某些實(shí)驗(yàn)室已用海洋細(xì)菌出ＴＴＸ。ＴＴＸ是一種氨基全氫化喹唑啉化合物,分子式為Ｃ11Ｈ17 Ｎ3Ｏ8,分子量為319 28, 其為無臭、易潮解的白色針狀結(jié)晶。ＴＴＸ易溶于水,部分溶于乙醇和冰醋酸,難溶于脂類溶劑。這兩種毒素均在弱酸性條件下穩(wěn)定,zui適宜ｐＨ值為4～5,對(duì)熱穩(wěn)定,煮沸后仍具有活性,但在強(qiáng)酸和堿性條件下不穩(wěn)定。在堿性條件下,ＴＴＸ可降解為幾種喹唑啉化合物。該毒素結(jié)構(gòu)的測定由Ｗｏｏｄ ｗａｒｄ（哈佛大學(xué)）、平田和后滕（名古屋大學(xué)）及津田小組（東京大學(xué)—三共中央研究所）等于1964年分別完成。其結(jié)構(gòu)如圖所示：

1  TTX的毒理作用

ＴＴＸ是通過與鈉離子通道受體結(jié)合,阻斷電壓依賴性鈉通道,從而阻滯動(dòng)作電位,導(dǎo)致與之相關(guān)的生理活動(dòng)的阻礙,主要是神經(jīng)肌肉的麻痹。構(gòu)效關(guān)系研究表明,ＴＴＸ的活性基團(tuán)是1、2、3位的胍胺基和附近的Ｃ4、Ｃ9、Ｃ10位的羥基,胍氨基在生理ｐＨ條件下發(fā)生質(zhì)子化,形成正電性活性區(qū)域,和鈉通道受體蛋白的負(fù)電性羰基相互作用,阻滯鈉離子進(jìn)入通道。業(yè)已證明,鈉通道受體至少有6個(gè)特異性靶分子結(jié)合位點(diǎn)。ＴＴＸ是與鈉通道受體部位Ⅰ結(jié)合。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),只有當(dāng)毒素應(yīng)用于膜外側(cè)時(shí),才能阻止鈉離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),對(duì)毒素與鈉通道更深入的研究顯示,毒素受體位于可興奮細(xì)胞膜外側(cè)、鈉通道外口附近。毒素與受體部位結(jié)合后,阻止鈉離子接近通道的外口,使鈉離子不能通過通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而使膜不能產(chǎn)生去極化。ＴＴＸ特異性地作用于鈉通道,對(duì)鉀通道、鈣通道等其它離子通道無直接影響,對(duì)神經(jīng)肌肉接頭的突觸及膽堿脂酶也無直接作用,因此它們被作為確定鈉通道位置的化學(xué)標(biāo)記物,是研究鈉通道的重要工具藥。單通道記錄結(jié)果表明ＴＴＸ阻塞鈉離子通道是一種“全或無”的方式,毒素和通道也是1∶1的關(guān)系,即一個(gè)毒素分子堵塞一個(gè)道。毒素分子與受體結(jié)合是可逆性的,并受各種陰、陽離子的影響,如Ｎａ+、Ｋ+、Ｍｇ2、Ｃａ2+等帶正電荷的陽離子可與毒素競爭受體,ＴＴＸ對(duì)鈉通道的阻滯具有選擇性,只阻滯電壓依賴性通道,而且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的鈉通道敏感性比心肌、骨骼肌上的鈉通道要高得多。毒素阻止鈉離子內(nèi)流導(dǎo)致動(dòng)作電位的阻滯,使動(dòng)作電位波幅及時(shí)程下降,0位相zui大上升速率降低。它們只阻滯動(dòng)作電位的傳導(dǎo),而對(duì)靜息電位、靜息膜電位和延遲整復(fù)等作用不明顯。

河豚毒素的檢驗(yàn)

2  TTX的中毒癥狀

ＴＴＸ使中樞呼吸節(jié)律減緩,并發(fā)現(xiàn)ＴＴＸ對(duì)髓部的節(jié)律發(fā)生有直接和持久的抑制作用,同時(shí)觀察到膈肌放電減慢,。這些研究表明毒素能透過血腦屏障進(jìn)入中樞并對(duì)中樞產(chǎn)生明顯的抑制作用。因此,目前一般認(rèn)為ＴＴＸ對(duì)呼吸和心血管系統(tǒng)的抑制是在中樞和外周共同作用的結(jié)果。河豚魚在我國沿海均有分布。ＴＴＸ在河豚魚體內(nèi)分布不均一,主要集中在卵巢和肝臟,肌肉則很少。人多因誤食中毒,中毒癥狀依人和食入毒素的量不同而不同,一般潛伏期短,食用后10ｍｉｎ至15ｈ發(fā)病,通常在3ｈ內(nèi)發(fā)病,病情發(fā)展迅速。胃腸道癥狀出現(xiàn)較早,表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉。局部皮膚麻或刺痛感,首先是口唇、舌尖麻木,繼而廣泛的肌肉麻痹。咽和喉麻痹,可導(dǎo)致失音。呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)為呼吸窘迫,紫紺。心血管系統(tǒng)則出現(xiàn)心律失常,血壓下降?；颊叨喔械缴眢w有“飄浮感”。瞳孔開始收縮,后散大。從發(fā)病到死亡,多數(shù)患者神志清醒。

3 幾種主要的檢測方法

3.1    反相液相色譜法（HPLC）

3.2    反相離子對(duì)-液相色譜法

3.3    毛細(xì)管區(qū)帶電泳法

4    防治措施

4.1    抗體　

ＴＴＸ是小分子化合物,只有反應(yīng)原性,而不具備免疫原性。目前,實(shí)驗(yàn)室制備ＴＴＸ抗體均是把ＴＴＸ與大分子血藍(lán)蛋白偶聯(lián)作為抗原,引發(fā)ＢＡＬＢ/Ｃ小鼠的免疫反應(yīng)。通過這種免疫反應(yīng)產(chǎn)生的單克隆抗體對(duì)毒素具有特異性。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),用ＴＴＸ與血藍(lán)蛋白結(jié)合物免疫ＢＡＬＢ/Ｃ小鼠產(chǎn)生的抗體能中和ＴＴＸ,抑制ＴＴＸ與鈉通道的結(jié)合,但對(duì)ＴＴＸ派生物及血藍(lán)蛋白均無反應(yīng)性。ＴＴＸ單抗能有效地拮抗ＴＴＸ對(duì)直接電刺激誘發(fā)的膈肌收縮和大鼠坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位的抑制作用,全細(xì)胞式鉗位記錄觀察到,當(dāng)ＴＴＸ使神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞鈉離子電流*消失后,加入抗體可使電流峰值恢復(fù)70%～80%,事先把ＴＴＸ和抗體混合1小時(shí)后加入,可使鈉離子電流峰值維持在90%,表明ＴＴＸ單抗能有效地拮抗ＴＴＸ對(duì)鈉離子電流的抑制作用。ＴＴＸ特異性抗體對(duì)ＴＴＸ中毒有很好的保護(hù)作用,小鼠先尾靜脈注入抗體,30ｍｉｎ后再注入ＴＴＸ,小鼠能全部存活,未給抗體組,小鼠全部死亡;若先口服ＴＴＸ,再給抗體,也能*拮抗ＴＴＸ的毒性?？贵w對(duì)拮抗ＴＴＸ中毒具有較好的作用,但抗體的制備、貯存困難,臨床應(yīng)用受到制約,目前尚無商業(yè)性的抗ＴＴＸ免疫球蛋白或單克隆抗體。群眾認(rèn)識(shí)河豚魚,提高對(duì)河豚魚危害性的認(rèn)識(shí)。對(duì)麻痹性貝類的預(yù)防,要在有污染危險(xiǎn)的海域嚴(yán)格執(zhí)行檢疫規(guī)則。

4.2    化學(xué)藥物　

ＴＴＸ致死的主要原因是呼吸抑制,因此以前曾用呼吸刺激劑治療,但無明顯效果。zui近,有多個(gè)研究報(bào)道4-氨基吡啶對(duì)ＴＴＸ中毒的拮抗作用。4-氨基吡啶是鉀離子通道的阻滯劑,能延緩鉀離子內(nèi)流,延長動(dòng)作電位,使突觸前末梢鈣離子內(nèi)流增多,從而增加突觸前乙酰膽堿的釋放,增強(qiáng)肌肉收縮能力。另外,4-氨基吡啶還有刺激呼吸作用及中樞興奮作用。研究報(bào)道,豚鼠給予致死劑量的ＴＴＸ,在膈肌收縮出現(xiàn)部分抑制后開始使用呼吸機(jī),于膈肌自主收縮消失后,立即靜脈注射4-氨基吡啶,可迅速逆轉(zhuǎn)動(dòng)物的膈肌收縮抑制、低血壓、心率過緩等效應(yīng),各指標(biāo)均能迅速恢復(fù)至正常水平甚至更高。但4-氨基吡啶毒副作用大,安全劑量范圍小,2ｍｇ/ｋｇ對(duì)ＴＴＸ的毒作用具有較好的拮抗效應(yīng),只個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)肌顫,4ｍｇ/ｋｇ則所有動(dòng)物都出現(xiàn)劇烈肌顫,抽搐,而治療作用沒有增強(qiáng)。因此4-氨基吡啶對(duì)ＴＴＸ中毒的治療效果、安全劑量范圍都有待進(jìn)一步研究。

4.3臨床治療　

目前臨床上對(duì)ＴＴＸ中毒尚無藥,主要采取綜合對(duì)癥治療措施。早期可催吐、洗胃,用2%碳酸氫鈉中和胃內(nèi)毒素?；钚蕴寄苡行У嘏c毒素結(jié)合,有學(xué)者推薦洗胃后通過鼻胃管給予活性碳用以中和胃內(nèi)殘*素,抑制毒素的吸收。因ＴＴＸ在堿性條件下不穩(wěn)定,靜脈給與碳酸氫鈉可能降低血中ＴＴＸ毒性。出現(xiàn)呼吸困難可氣管插管進(jìn)行機(jī)械呼吸。我國一些學(xué)者總結(jié)臨床治療經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為在其他支持療法的配合下,早期大劑量應(yīng)用莨菪堿類藥物有較好療效。國外有報(bào)道,可逆性膽堿脂酶抑制劑藤喜龍、吡啶斯的明、新斯的明等在ＴＴＸ中毒后能增強(qiáng)肌肉運(yùn)動(dòng)能力,可早期使用。但這些藥物療效均無嚴(yán)格的臨床對(duì)照,目前也沒有一種經(jīng)驗(yàn)性的用藥被*是有效的。

5    預(yù)防　

ＴＴＸ耐熱性好,煮沸也不能使其失去活性,因此食用時(shí)必須掌握科學(xué)方法。另外,在沿海地區(qū)要加強(qiáng)宣傳,使群眾認(rèn)識(shí)河豚魚,提高對(duì)河豚魚危害性的認(rèn)識(shí)。對(duì)麻痹性貝類的預(yù)防,要在有污染危險(xiǎn)的海域嚴(yán)格執(zhí)行檢疫規(guī)則?！?/font>