進口分裝ELISA試劑盒PCR方法技術(shù)分析

(一)試劑

(1)引物:決定擴增的特異性。進口分裝ELISA試劑盒根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生

物都有自己特異的引物。

(2)耐熱的DNA聚合酶:此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫90℃-100℃。

(3)10×PCR緩沖液:500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。

(4)5mmol/L dNTP貯備液:將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃保存。dNTP濃度用UV吸收法測定。現(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產(chǎn)品。

(二)操作程序

過去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下:

(1)向一微量離心管中依次加入

DNA模板 102-105拷貝

進口分裝ELISA試劑盒引物 各1μmol/L

dNTP 各200μmol/L

10×PCR緩沖液 1/10體積

ddH2O 補到終體積(終體積50μl-100μl)

混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。

(2)加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。

(3)冷至延伸溫度時，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。

(4)PCR的循環(huán)程序為:94℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。zui后一次循環(huán)結(jié)束后，進口分裝ELISA試劑盒再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。