由于RNA酶的廣泛存在與難以滅活的頑固特性。使得RNA的提取純化和后續(xù)工作變得非常困難。

    RNA工作的主要問(wèn)題是防止RNA酶的污染。除了操作時(shí)需要注意RNA酶，那么針對(duì)不同類(lèi)型的樣本，進(jìn)行RNA純化時(shí)有哪些需要注意的地方呢？

從纖維組織中進(jìn)行RNA純化

    從富含纖維的組織中分離 RNA（如心臟或肌肉組織等）有一定難度，這是因?yàn)槔w維組織中的收縮蛋白，結(jié)締組織，膠原等成分都會(huì)干擾 RNA 的純化過(guò)程。所以為了去除這些蛋白的影響，組織樣本需要用含有蛋白酶或含酚的裂解液。同時(shí)上述處理?xiàng)l件不能引起 RNA 降解，QIAGEN 推薦使用 RNase-free proteinase K 進(jìn)行消化。

從 FFPE 樣本中純化 RNA

    固定和包埋的過(guò)程能導(dǎo)致核酸的嚴(yán)重降解和化學(xué)修飾，通常我們從 FFPE 樣本中純化得到的核酸的分子量要小于新鮮或冰凍組織。核酸降解/片段化的程度依賴(lài)于樣本類(lèi)型和年齡，另外和固定，包埋和儲(chǔ)存條件也有很大關(guān)系。

從血液樣本中進(jìn)行 RNA 的純化

    全血中紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核，每毫升血液中實(shí)用細(xì)胞數(shù)少，核酸得率比較低，所以從全血中分離的目標(biāo)是白細(xì)胞。此外，還必須除去污染物如抗凝劑肝素和 EDTA 以及天然存在的酶抑制劑，這些物質(zhì)都會(huì)干擾下游的 RNA 分析。QIAamp RNA Blood Kits 高度適合從人血液樣本中純化高品質(zhì)RNA，能消除 RNases，污染物和酶抑制劑，同時(shí)zui大程度去除基因組 DNA 的污染。

從血清，血漿及其他無(wú)細(xì)胞體液中純化游離 RNA

    RNA 尤其是 miRNA 可在血清，血漿，尿液和其他體液中存在，并且也存在于細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液中。胞外 RNA 的含量比胞內(nèi) RNA 要低的多，但是它相對(duì)穩(wěn)定，在人全血中的半衰期約為 2天。然而，多次反復(fù)凍融仍然會(huì)導(dǎo)致純化效果變差。推薦純化過(guò)程中使用 carrier RNA 來(lái)提高游離 RNA 的回收效率。

  關(guān)于病毒 RNA 純化

    一些病毒具有單鏈或雙鏈 RNA 基因組。病毒 RNA 通常是分離自無(wú)細(xì)胞體液中，而這些樣本中病毒核酸的含量非常低。 病毒顆?？赡苄枰ㄟ^(guò)超速離心，超濾或沉淀的方式進(jìn)行濃縮。推薦純化過(guò)程中使用 carrier RNA 來(lái)提高游病毒 RNA 的回收效率。另外推薦使用合適的逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)某些含有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的病毒核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。