1. 溶液準(zhǔn)備：

RIPA緩沖液：50mM Tris-HCl pH7.4 ，150mM NaCl ，1mM EDTA，1%Triton×100，1%去氧膽酸鈉，0.1%SDS，1mM PMSF，1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制劑 （ aprotinin ） ， 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 （ leupeptin ）

PBS （ pH7.4 ） ：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4 ，50mM NaCl ，2.7mM KCl

1×樣品緩沖液：65mM Tris-HCl （ pH8.0 ），10% （ v/v ） 甘油，2.3%（w/v） SDS，0.01% 溴酚藍(lán)，1% DTT

2. 實(shí)驗(yàn)程序：

1  ） 用PBS-EDTA或胰蛋白酶水解液收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2  ） 按1ml/107個(gè)細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA緩沖液來裂解細(xì)胞，4℃搖1h。

3  ） 10000g,4℃離心20min，取上清液。

4  ） 用PBS清洗蛋白A/G瓊脂糖顆粒兩次，用RIPA緩沖液稀釋瓊脂糖顆粒至濃度為50%。

5  ） 按每50ml顆粒懸浮液需1ml細(xì)胞裂解液計(jì)算需要裂解液體積，取相應(yīng)體積數(shù)的裂解液在4℃條件下?lián)u10min。10000g，4℃離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新管中。

6  ） 按每5×106 個(gè)細(xì)胞加0.5ml細(xì)胞裂解液，取相應(yīng)的裂解液到新管中準(zhǔn)備免疫共沉淀（IP）反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)中加入8-15μg抗體，冰上搖3h。

7  ） 加50ml 50%顆粒懸浮液，4℃搖1h。

8  ） 10000g離心15s，棄上清。

9  ） 用1ml RIPA緩沖液洗滌顆粒兩次，以除去無特異結(jié)合的蛋白，然后用1ml PBS洗滌3次。

10） 60μl樣品緩沖液懸浮顆粒，95℃煮沸5min；SDS-PAGE電泳前樣品10000g短時(shí)離心15s。