非放射性標(biāo)記原位雜交技術(shù)的興起和發(fā)展，為雙重標(biāo)記原位雜交提供了有效的技術(shù)途徑。在將放射性核素和非放射性物質(zhì)標(biāo)記的兩種探針結(jié)合進(jìn)行的雙重標(biāo)記原位雜交技術(shù)中，常用的放射性核素標(biāo)記物為35 S，常用的非放射性標(biāo)記物為生物素。該雙重原位雜交技術(shù)可分為一步法和二步法兩種。抗體

在一步法中，原位雜交反應(yīng)用兩種探針的混合物一次完成，顯示雜交信號(hào)時(shí)，先用堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素與雜交體上的生物素結(jié)合，并用硝基四氮唑(NBT)和5―溴―4―氯―3―吲哚―磷酸鹽(BCIP)作為底物顯示雜交體上的堿性磷酸酶(或用ABC法顯示雜交體上的生物素)或以堿性磷酸酶標(biāo)記的抗抗體與雜交體上的結(jié)合，并用NBT和BCIP顯示堿性磷酸酶，標(biāo)本脫水干燥后再進(jìn)行放射自顯影處理以顯示另一靶核酸。一步法的優(yōu)點(diǎn)是雜交反應(yīng)一次完成，操作流程較短，同一細(xì)胞內(nèi)的兩種信號(hào)容易分辨；缺點(diǎn)是放射自顯影的陽性信號(hào)要比單標(biāo)時(shí)明顯減少，堿性磷酸酶或ABC的陽性反應(yīng)產(chǎn)物有可能會(huì)引起核乳膠的化學(xué)顯影。

在二步法中，先后使用不同的探針進(jìn)行兩次雜交反應(yīng)，一般先用35 S標(biāo)記探針進(jìn)行原位雜交，放射自顯影顯示*種雜交體后再用生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行第二次原位雜交，按生物素―親和素―堿性磷酸酶法(或ABC法)―抗抗體―堿性磷酸酶法顯示第二種雜交體。二步法的雜交信號(hào)在鏡下明顯可辨。用放射性核素標(biāo)記探針進(jìn)行*次原位雜交的整個(gè)操作順序，包括放射自顯影的顯影定影過程，不會(huì)改變mRNA的結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響第二次雜交反應(yīng)時(shí)靶核酸對(duì)探針的可及性。二步法的整個(gè)操作流程要比一步法長(zhǎng)，但它沒有一步法中存在的放射性標(biāo)記信號(hào)的丟失，以及堿性磷酸酶(或ABC)陽性反應(yīng)產(chǎn)物可能引起乳膠化學(xué)顯影的弊端。