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Western及IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑)操作說(shuō)明
產(chǎn)品介紹：
Western及IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑)是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞或組織樣品從而制備蛋白樣品的裂解液。本細(xì)胞裂解液裂解的細(xì)胞或組織樣品，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)，免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等，以及許多兼容1% Triton X-100的酶活性或者生物小分子的檢測(cè)。使用本裂解液時(shí)，用戶可以根據(jù)具體用途自行添加特定抑制劑或者不添加抑制劑。
本產(chǎn)品可以用于動(dòng)物、植物的細(xì)胞或組織樣品，也可以用于真菌或細(xì)菌樣品。
操作方法：
對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：
1、融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，根據(jù)需要自行確定添加適當(dāng)?shù)囊种苿┗虿惶砑右种苿?/span>
2、對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解。
3、充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入100微升裂解液即可，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加量到150微升或200微升。每100萬(wàn)細(xì)胞用100微升本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為2-4mg/ml，不同細(xì)胞有所不同。
對(duì)于組織樣品：
1、把組織剪切成細(xì)小的碎片。
2、融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，根據(jù)需要自行確定添加適當(dāng)?shù)囊种苿┗虿惶砑右种苿?/span>
3、按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
4、用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5、充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。
6、如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈渦旋使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
注意事項(xiàng)：
1、如需添加蛋白酶抑制劑等，需自行準(zhǔn)備。
2、裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
3、對(duì)于某些特殊蛋白的IP，若Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強(qiáng)、中或弱)或NP-40裂解液。如果IP的時(shí)候背景很高，則應(yīng)考慮選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強(qiáng)或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無(wú)法被IP下來(lái)，則說(shuō)明裂解液的強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液 (弱)或NP-40裂解液。
4、對(duì)于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液 (P0013)效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強(qiáng)、中)或SDS裂解液。
5、本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用，不做其它用途。
6、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
