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Caspase-1酶活性測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明
描述：
Caspase是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的蛋白酶家族，包含10多個(gè)成員。其中Caspase-1是唯-一可剪切IL-1b和IL-18前體產(chǎn)生活性細(xì)胞因子的caspase。Caspase-11剪切45kD的caspase-1前體蛋白產(chǎn)生20kD和10kD片斷，這兩個(gè)片斷可以形成異源二聚體，并進(jìn)一步形成四聚體。此四聚體具有蛋白酶活性。Caspase-1通過(guò)剪切Bcl-XL調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子前體的剪切來(lái)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)。測(cè)定原理基于Caspase-1特異水解多肽底物Tyr-Val-Ala-Asp-p-nitroanilide (YVAD-pNA)，釋放的游離硝基苯胺pNA在405 nm有最大吸光度。采用可見(jiàn)光光度比色法測(cè)定pNA而得到Caspase活性。適用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞Caspase-1活性。
所需儀器：
可見(jiàn)光分光光度計(jì)配100μl比色杯，或酶標(biāo)儀。最佳波長(zhǎng)405 nm，也可測(cè)OD400~450 nm但靈敏度略降。
組織細(xì)胞準(zhǔn)備：
Caspase活性測(cè)定值低，最常見(jiàn)原因是未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少，其次是觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí)，并非劑量越大時(shí)間越長(zhǎng)Caspase活性就越高?？稍O(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2、4、8、16、24小時(shí)，以檢測(cè)最佳的觀察點(diǎn)。通常2×107細(xì)胞或2mg組織裂解于1ml可產(chǎn)生1~3mg/ml蛋白。初次測(cè)定時(shí)，單個(gè)測(cè)定反應(yīng)可加~200μg蛋白物對(duì)應(yīng)于2×106細(xì)胞或2個(gè)孔的6孔板細(xì)胞。最少，單個(gè)測(cè)定反應(yīng)需加20μg蛋白對(duì)應(yīng)于2×105個(gè)細(xì)胞或2個(gè)孔的12孔板細(xì)胞。勿用絲氨-酸蛋白酶抑制劑如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。
1. (1)細(xì)胞裂解：1000g 5分鐘收集細(xì)胞，吸盡上清。每2~10×106細(xì)胞加50~100µl裂解液震蕩裂解，冰浴10分鐘，再次震蕩。(2)組織裂解：3~10mg組織加100 µl裂解液放入小型玻璃勻漿器，上下勻漿30次。轉(zhuǎn)移勻漿液于離心管。
2. 4 oC 12,000g 10分鐘，取上清測(cè)定，或-70 oC保存。
3. 蛋白定量：用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。裂解液含還原劑不宜采用BCA法。應(yīng)使蛋白濃度達(dá)到1-3 mg/ml，相當(dāng)于每10 μl待測(cè)樣品含10-30μg蛋白，否則應(yīng)增加細(xì)胞用量。
測(cè)定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線：
1. 用反應(yīng)緩沖液稀釋10mM pNA標(biāo)準(zhǔn)品為200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。設(shè)置不加pNA的零管。
2. 每一濃度取100 μl加入96孔板或100μl比色杯，測(cè)定405nm吸光度OD值。
3. 每一濃度標(biāo)準(zhǔn)管OD405值為x軸，對(duì)應(yīng)的pNA濃度為y軸，用Excel制作pNA濃度對(duì)OD405值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品測(cè)定操作：
1. 按下表設(shè)置96孔板反應(yīng)體系。底物最后加入以使各管反應(yīng)起始時(shí)間相同。設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照管。酶活力不足或過(guò)高，可增加或減少樣品。
2. 蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC反應(yīng)2小時(shí)，肉眼可見(jiàn)顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2，此時(shí)即可測(cè)定。顏色變化不明顯可延長(zhǎng)反應(yīng)或過(guò)夜，但酶活性較強(qiáng)時(shí)，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。
3. 樣品管OD405減去空白對(duì)照OD405，為樣品Caspase水解底物產(chǎn)生的pNA吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并以蛋白濃度校正之。
4. 測(cè)得的Caspase酶活性表示方法有兩種。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 實(shí)驗(yàn)處理組OD / 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組OD，簡(jiǎn)單而可靠。(2)樣品Caspase酶活力單位/mg protein，精確但計(jì)算較復(fù)雜，參見(jiàn)說(shuō)明。
