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嘌呤霉素鹽酸鹽廣泛用于抑制蛋白合成
嘌呤霉素(Puromycin)是一種黑鏈霉菌屬產(chǎn)生的氨基核苷抗生素,廣泛用于抑制蛋白合成。作用原理是因其具有與tRNA分子中腺苷相連結(jié)的氨基酸末端類似的結(jié)構(gòu), 能夠同氨基酸結(jié)合，代替氨?；膖RNA同核糖體的A位點結(jié)合，并摻入到延伸的肽鏈中。雖然嘌呤霉素能夠同A位點結(jié)合,但是不能參與隨后的任何反應(yīng),因而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。嘌呤霉素對原核和真核生物的翻譯過程均有干擾作用。嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC)，賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。用作蛋白質(zhì)合成的抑制劑。抑制細菌、藻類原生物和哺乳動物細胞生長。
操作說明
一、溶液濃度
用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后分裝于-20°C凍存;也可溶于甲醇，配制成10 mg/mL的儲存液。哺乳動物細胞的推薦使用濃度為1-15 μg/mL，佳濃度需由殺滅曲線來確定。LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125μg/mL。(使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細胞本身的影響。)
注意：嘌呤霉素為有毒化合物，使用試劑前，請帶手套、口罩等防護措施。
附：滅菌曲線確定方法
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期等均有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達的細胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染細胞的低嘌呤霉素濃度至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺滅曲線。若細胞對嘌呤霉素耐受性較高，則可能需要大于常規(guī)濃度。
1) 第1天:在24孔板中以6-8×104/孔的細胞密度鋪板，鋪足夠量的孔以進行后續(xù)的梯度實驗。37°C細胞孵育過夜。
2) 第2天:
a)準備篩選培養(yǎng)基:含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如1-15μg/mL，至少5個梯度，參考文獻對應(yīng)細胞相應(yīng)殺滅大概濃度);
b)往孵育過夜后的細胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基;之后37°C孵育細胞。
3) 第4天:更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細胞存活率。
4) 根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。
5) 每日監(jiān)測細胞，觀察存活細胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的藥物低濃度。
