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ELISA的基本原理和操作步驟

1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assayELISA）用于IgG定量測定的文章使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法這一方法的基本原理是：

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性

②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性又保留酶的性在測定時(shí)把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開。

zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例加入酶反應(yīng)的底物后底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析由于酶的催化頻率很高故可極大地地放大反應(yīng)效果從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

方法類型和操作步驟

ELISA可用于測定抗原也可用于測定抗體在這種測定方法中有3種必要的試劑：

①固相的抗原或抗體

②酶標(biāo)記的抗原或抗體

③酶作用的底物

根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法

（一）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法

操作步驟如下：

（1）將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)

（2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合形成固相抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)

（3）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)

（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量根據(jù)同樣原理將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體

ELISA的基本原理和操作步驟

（二）雙位點(diǎn)一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時(shí)如應(yīng)用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。

這種雙位點(diǎn)一不但簡化了操作縮短了反應(yīng)時(shí)間如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體測定的敏感性和特異性也顯著提高單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELIS在一步法測定中應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)。

（hookeffect）類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí)過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合而不再形成夾心復(fù)合物所得結(jié)果將低于實(shí)際含量鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果

（三）間接法測抗體

間接法是檢測抗體zui常用的方法其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體故稱為間接法

操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復(fù)合物經(jīng)洗滌后固相載體上只留下特異性抗體其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合在洗滌過程中被洗去

（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶洗滌后固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量例如欲測人對某種疾病的抗體可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體

（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量本法只要更換不同的固相抗原可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體

（四）競爭法

競爭法可用于測定抗原也可用于測定抗體以測定抗原為例受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比

操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌

（2）待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液使之與固相抗體反應(yīng)如受檢標(biāo)本中無抗原則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合如受檢標(biāo)本中含有抗原則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會與固相抗體結(jié)合競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少參考管中只加酶標(biāo)抗原保溫后酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量。

ELISA的基本原理和操作步驟

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