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乳鐵蛋白的分離和檢測(cè)方法

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，中性粒細(xì)胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白。其分子量為80 kDa，主要由上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌。

1939年Sorensen等人在分離乳清蛋白時(shí)得到一種紅色蛋白，Polis等人在分離Lp時(shí)也得到部分純化的紅色蛋白，但至1959年Groves用色譜得到純的紅色物質(zhì)后，才確認(rèn)這種紅色物質(zhì)是一種與鐵結(jié)合的糖蛋白，稱之為乳鐵蛋白。

乳鐵蛋白不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強(qiáng)大生物功能，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。

乳鐵蛋白是由科學(xué)家MONTREUIJ和JOHANSONB于1960年在母乳中發(fā)現(xiàn)的，隨后BAGGIN等科學(xué)家在一些生物體的體液和各種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這種蛋白質(zhì)并開始了大量研究。

研究表明，乳鐵蛋白是動(dòng)物初乳中的天然蛋白質(zhì)，是一種多功能蛋白質(zhì)。研究表明，乳鐵蛋白肽具有廣泛的生物學(xué)活性，包括廣譜抗菌作用、消炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和開發(fā)潛力的食品、化妝品添加劑，市場(chǎng)前景廣闊。

2012年3月30日，中國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》將乳鐵蛋白列入GB14880-2012，認(rèn)定為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，乳鐵蛋白也是母乳中含有的*的成份，可以抑制病毒和有害菌，有提高嬰兒免疫力的作用。

目前報(bào)道的Lf分離方法很多，主要有色譜法（吸附色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、固定化單系抗體法等）和超濾法。

色譜法的優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、純度高，抗體被固定化可重復(fù)使用，其缺點(diǎn)是柱的制備工藝復(fù)雜，抗體成本昂貴，難以工業(yè)化生物試劑。超濾法操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用相對(duì)較低，易于形成工業(yè)化規(guī)模，其缺點(diǎn)是乳鐵蛋白純度較低，膜需經(jīng)常清洗。

超濾法是生物試劑食品用乳鐵蛋白實(shí)現(xiàn)工業(yè)化潛力的方法之一 ，具有*的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

乳鐵蛋白及其蛋白降解產(chǎn)物—乳鐵蛋白肽具有廣泛的生物學(xué)活性，包括廣譜抗菌作用、消炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和開發(fā)潛力的食品、化妝品添加劑，如美國(guó)食品藥品管理局早巳允許乳鐵蛋白作為用于運(yùn)動(dòng)、功能性食品。

乳鐵蛋白的分離和檢測(cè)方法

乳鐵蛋白屬于先天免疫系統(tǒng)的成分物質(zhì)。除了能夠結(jié)合和運(yùn)輸鐵離子的主要功能外，乳鐵蛋白還具有抗菌，抗病毒，抗寄生蟲，催化，防癌抗癌，抗過敏和輻射防護(hù)的功能和屬性。

母乳與配方奶粉相比，母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒能更有效的利用母乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也不易患各種感染性疾病，保持正常生長(zhǎng)和發(fā)育，主要是因?yàn)槟溉橹泻腥殍F蛋白、免疫球蛋白和溶菌酶等多種活性蛋白，能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收，并保護(hù)機(jī)體免受微生物感染。

其中乳鐵蛋白還通過促進(jìn)胃腸道，特別是黏膜免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育，在機(jī)體免疫防疫系統(tǒng)方面起著重要作用，奶粉中添加了乳鐵蛋白更接近母乳，從而強(qiáng)化這些免疫因子能增加其免疫功能。

原理：混有乳鐵蛋白(LF) 抗原的瓊脂糖傾入平板，凝凍后打一些小孔，接入LF樣品。隨著抗原呈放射形擴(kuò)散， 在以小孔為中心的環(huán)狀區(qū)域形成抗原?抗體反應(yīng)沉淀帶， 沉淀帶在RID染色液的作用下被染色，環(huán)的直徑與抗體(LF)的濃度成正比。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)出樣品中的(LF) 濃度。

操作步驟：將預(yù)涂過的玻璃板置于水平桌面上，在瓊脂糖緩沖液中 加入150ml(抗血清，仔細(xì)混合后將溶液倒在玻璃板中心。表面張力可以阻止溶液溢出，必要時(shí)用試管上緣幫助溶液分散以確保溶液均勻分散到玻璃板的各邊。

將凝膠在室溫下固化15min，然 后置于恒濕器中在冰箱中保存1h 。將打孔器與抽真空設(shè)備連接，并利用帶模板的隔板架在凝膠上 打16個(gè)小孔。

用注射器小心地將12.5ml樣品注入玻璃板中，將凝膠置于恒濕器中，室溫下在水平桌面上放置48h后清洗凝膠。選擇正確角度，2次測(cè)量環(huán)的直徑，以此來測(cè)定LF濃度。

結(jié)果計(jì)算：每毫升LF的濃度(×10 ) =
式中：A為L(zhǎng)F標(biāo)準(zhǔn)溶液(mg/mL) ；
W為質(zhì)量(mg) 。

乳鐵蛋白的分離和檢測(cè)方法

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ELISA試劑盒：進(jìn)口ELISA試劑盒,國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒,人elisa試劑盒，大鼠ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒等。
培養(yǎng)基：微生物培養(yǎng)基,顯色培養(yǎng)基,BD培養(yǎng)基,gibco培養(yǎng)基等。
血清：胎牛血清,人血清,動(dòng)物血清，NQBB,Hyclone，Gbico原裝血清 。
生物試劑：Amresco,Sigma,ABM,BIO-RAD,BD,ABCAM等進(jìn)口試劑。
標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品：進(jìn)口對(duì)照品,進(jìn)口對(duì)照藥材,進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品.
抗體：一抗,二抗，流式抗體等。
放免檢測(cè)服務(wù)：進(jìn)口放免檢測(cè)服務(wù)，國(guó)產(chǎn)放免檢測(cè)服務(wù)，進(jìn)口美國(guó)鳳凰等放免檢測(cè)服務(wù)。
實(shí)驗(yàn)室代測(cè)服務(wù)：放免代測(cè)，WB實(shí)驗(yàn)，免疫組化代測(cè)，熒光定量PCR代測(cè)，病理細(xì)胞染色代測(cè)，生化實(shí)驗(yàn)代測(cè)等。