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南京信帆生物技術(shù)有限公司 |  資料大小 |
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 資料類型 |
WORD 文檔 |  資料圖片 |
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ELISA 的樣本實驗準備
在收集樣本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當天就進行檢測的樣本，及時儲存在4℃?zhèn)溆谩τ诟籼煸贆z測的樣本，及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆茫袟l件的，-70℃凍存?zhèn)溆?。標本?yīng)避免反復凍融。
液體類標本: 包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。
- 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
- 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
- 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
- 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。
- 培養(yǎng)細胞：檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
- 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑，用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
- 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融.
- 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
第三部分 ELISA試劑盒的檢測目的和實驗原理
1.檢測目的
本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc) 含量。
2.實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc) 水平。用純化的小鼠P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc) 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc) ，再與HRP標記的P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc) 抗 體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc) 呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標 準曲線計算樣品中小鼠P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc) 濃度。
第四部分 試劑盒組成
試劑盒組成 | 48T | 96T | 保存 |
說明書 | 1份 | 1份 |
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封板膜 | 2片（48） | 2片（96） |
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密封袋 | 1個 | 1個 |
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酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
標準品（400 ng/L） | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品稀釋液 | 1.5ml×1瓶 | 1.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
濃縮洗滌液 | (20倍)20ml×1瓶 | (30倍)20ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
第五部分 操作步驟
- 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
200 ng/L | 5 號標準品 | 150µl 的原倍標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
100 ng/L | 4 號標準品 | 150µl 的 5 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
50 ng/L | 3 號標準品 | 150µl 的 4 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
25 ng/L | 2 號標準品 | 150µl 的 3 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
12.5 ng/L | 1 號標準品 | 150µl 的 2 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液 |
- 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl， 然后再加待測樣品 10µl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
- 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
- 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 5 次，拍干。
- 加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外。
- 溫育：操作同 3。
- 洗滌：操作同 5。
- 顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
10 分鐘.
- 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
- 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
