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谷胺酰胺合成酶試劑盒說(shuō)明書(shū)
谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說(shuō)明書(shū)
測(cè)定意義 分光光度法
GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨 酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過(guò)多的銨離子對(duì)生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲(chǔ) 存和運(yùn)輸形式。
測(cè)定原理
GS 在 ATP 和 Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─ 谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下與鐵形成紅色的絡(luò)合物；該絡(luò)合物在 540nm 處有zui大吸 收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。
所需的儀器和用品
可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。
試劑的組成和配制
提取液：30mL×1 瓶，4℃保存。 試劑一：10mL×1 瓶，-20℃保存。 試劑二：10mL×1 瓶，-20℃保存。
試劑三：粉劑×2 瓶，-20℃保存。用時(shí)每瓶加入 5mL 蒸餾水充分溶解備用，用不完的試劑仍
-20℃保存。
試劑四：10mL×1 瓶，4℃保存。
樣本測(cè)定的準(zhǔn)備
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL
提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 在 EP 管中加入下列試劑：
試劑名稱（μL） | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
試劑一 | 320 |
|
試劑二 |
| 320 |
試劑三 | 140 | 140 |
樣本 | 140 | 140 |
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 30min
試劑四 | 200 | 200 |
混勻，靜置 10min 后，5000g，常溫離心 10min，取上清液測(cè)定 540nm 處的吸光值 A。△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
GS 活力單位的計(jì)算
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每 min 使 540nm 下吸光值變化 0.01 定義 為一個(gè)酶活力單位。
GS（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每 min 使 540nm 下吸光值變化 0.01 定義為一個(gè) 酶活力單位。
GS（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =19×ΔA÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.8mL； V 樣：加入樣本體積，0.14mL；V 樣總：加入提取液 體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
