在ELISA試劑盒中，常用的酶為辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosohatase, AP）。在少數(shù)商品ELISA試劑盒中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
    國產(chǎn)ELISA試劑盒一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有zui高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用RZ（Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥7.0。
     HRP除符合上述的ELISA試劑盒中標記酶的要求外，更有價格低廉和性質較穩(wěn)定的特點。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應注意酶的活力。高純度的酶如保存不當，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進行試驗。
國外很多ELISA試劑盒采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，zui適pH為9.6。在ELISA試劑盒中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴，制備結合物所得率也較HRP低。