標(biāo)本的搜集和保存

用于ELISA試劑盒標(biāo)本zui為常用的是血清(漿)，有時由于特定的檢測意圖，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本?，F(xiàn)在上運用血清標(biāo)本測定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和醫(yī)治藥物等。對用于激素和醫(yī)治藥物測定的血清標(biāo)本的搜集，要留意搜集時刻甚或體位有可能會對測定成果發(fā)生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值呈現(xiàn)：成長激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發(fā)性辦法釋放，因而，在測定此類激素時，有必要在親近相連的時刻距離內(nèi)采納數(shù)份血樣本，以其中間值為測定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r，血清中腎素活性將呈現(xiàn)明顯增高。再如醫(yī)治藥物的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)挑選服藥后的zui適時刻抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測的血清標(biāo)本的搜集則沒有時刻和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

(1)要留意防止呈現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因而，在以HRP為符號酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很簡單在溫育過程中吸附于固相，然后與后邊參加的HRP底物反響顯色。

(2)樣本的收集及血清別離中要留意盡量防止細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的成長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白發(fā)生分化效果;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶自身會對用相應(yīng)酶作符號的測定辦法發(fā)生非特異性攪擾。

(3)血清標(biāo)本如是以無菌操作別離，則能夠在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則主張冰凍保存。樣本的長時刻保存，應(yīng)在-70℃以下。

(4)冰凍保存的血清標(biāo)本須留意防止因停電等形成的重復(fù)凍融。標(biāo)本的重復(fù)凍融所發(fā)生的機械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子發(fā)生損壞效果，然后引起假陰性成果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)留意，不要進(jìn)行劇烈振動，重復(fù)顛倒混勻即可。

(5)標(biāo)本在保存中如呈現(xiàn)細(xì)菌污染所形成的的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉積后取上清檢測。

試劑預(yù)備

在試驗室，對試劑預(yù)備一般不太留意，一般的做法是，在試驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而疏忽了這種做法有可能影響后邊溫育時刻不夠的問題，其直接的結(jié)果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測呈現(xiàn)假陰性。因而在ELISA測定中試劑的預(yù)備zui為要害的是，在試驗開端前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在運用前與室溫平衡。這樣做的意圖，首要是為了在后邊的溫育反響過程中，能使反響微孔內(nèi)的溫度能較快地到達(dá)所要求的高度，以滿意測定要求。其次，現(xiàn)在的產(chǎn)品ELISA試劑盒中的洗板液均需在試驗室運用時對所提供的濃縮液稀釋制造，因而稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)確保質(zhì)量。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時，則底物溶液應(yīng)在反響顯色前暫時制造。

加血清樣本及反響試劑

在現(xiàn)在的ELISA試劑盒產(chǎn)品中，血清樣本的參加幾乎是僅有的要運用微量加樣器參加樣本的過程。運用微量加樣器加樣有必要留意的要害點是：加樣不行太快，要防止加在孔壁上部，不行濺起和發(fā)生氣泡。加樣太快，無法確保微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺起會對附近孔發(fā)生污染。呈現(xiàn)氣泡則反響液界面有差異。試劑的參加在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要留意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很簡單呈現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)呈現(xiàn)非特異吸附，然后引起非特異顯色。所以，有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的過錯所形成的。

溫育

溫育是ELISA測定中影響測定勝敗zui為要害的一個要素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反響在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，有必要在必定的溫度條件下反響必定的時刻。溫育所需時刻與溫度成反比，即溫度越高，則所需時刻相對較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。

溫育這一步是臨床ELISA測定中zui簡單呈現(xiàn)問題的過程。一般現(xiàn)在國內(nèi)ELISA產(chǎn)品試劑盒的反響溫育時刻為37℃ 30分鐘～1小時，進(jìn)口ELISA試劑盒則一般為37℃ 1～2小時才干有較*的結(jié)合，低于1小時，可能會影響測定下限。因而，關(guān)于溫育，在實踐測定操作中必定要留意以下幾點：

要確保在設(shè)定的溫度下有滿足的反響時刻。一般來說，加完樣本和/或反響試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需求必定的時刻，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時刻可能還比較長，而在臨床試驗室中，很少有人留意這個問題，一般是將微孔板一放入溫箱即開端計時，這樣就很簡單形成實踐測定中溫育時刻不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南邊的血站同行提出了一個問題，就是在每一年的冬季總有那么一個多月的時刻，在做HBsAg測定的室內(nèi)質(zhì)控中，測定由臨床查驗中心供給的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原由于何?這可能就與南邊冬季室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時刻不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因而，為確保37℃下滿足的溫育時刻，臨床試驗室可自行確定本試驗室不同時節(jié)(不同室溫下)微孔板從室溫拿至溫箱后需求多長時刻孔內(nèi)溫度才干到達(dá)37℃，然后恰當(dāng)延伸板條在溫箱中的放置時刻。詳細(xì)的做法是，用一小溫度計放置板孔反響溶液中測量調(diào)查即可。