ELISA試劑盒操作過程復雜，影響反響要素較多，特別是固相載體的包被難到達各個別之間的共同，因此在定量測定中，每批測驗均須用一系列不一樣濃度的參考規(guī)范品在一樣的條件下制作規(guī)范曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA試劑盒，規(guī)范曲線的規(guī)模通常較寬，曲線zui高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢查物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線通常呈S形，其頭、尾部曲線趨于平整，中心較呈直線的有些是的檢查區(qū)域。

溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度。在建立ELISA辦法作反響動力學研討時，試驗標明，兩次抗原抗體反響通常在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)品的生成可達高峰。為加快反響，可進步反響的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度?？乖贵w反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中一夜，以形成zui多的沉淀。但因所需時刻太長，在ELISA中通常不予選用。

保溫的方法除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，通常均選用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA試劑盒板底應貼著水面，使溫度敏捷平衡。為防止蒸騰，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反響板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA試劑盒板應放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性杰出的資料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui終將ELISA試劑盒放在濕紗布上。

濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)則的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反響板均不宜疊放，以確保各板的溫度都能敏捷平衡。室溫溫育的反響，操作時的室溫應嚴厲約束在規(guī)則的規(guī)模內(nèi)，規(guī)范室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的請求操控溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只需平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時刻應按規(guī)則力求。為確保這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板一起測定。