雞腫瘤壞死因子α（TNF-a）試劑盒試驗原理：

        TNF-A試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知TNF-A濃度的標準品、未知濃度的樣品 加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將TNF-A和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-A的濃度呈比例關(guān)系。

樣品收集、處理及保存方法：

1、 血清……操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清

2、和紅細胞迅速小心地分離。

2、  血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、  細胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、  組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

 5、  保存……如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

雞腫瘤壞死因子α（TNF-a）試劑盒注意事項：

●   試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。

●   實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

●   不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

●   使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

●   使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

●   底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

●   加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

●   按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

雞腫瘤壞死因子α（TNF-a）試劑盒操作步驟：

1.   使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2.   根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3.   加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

4.   甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5.   每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6.   甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7.   每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

8.   取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9.   在450nm波長處測定各孔的OD值。