ELISA試劑盒檢測重組蛋白的研發(fā)

時間：2013/11/1閱讀：550

　　ELISA試劑盒采用RT-PCR擴增出大小409bp豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白基因（PRRSV N gene）,將該基因克隆到表達載體pGEX-KG,構(gòu)建重組表達載體pGEX-KG-N,轉(zhuǎn)化表達菌株BL21（DM3）誘導(dǎo)表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析表明,重組N蛋白獲得了表達,融合蛋白相對分子質(zhì)量為41 000,并具有良好的免疫學(xué)活性。ELISA試劑盒置4℃前提保留12個月,試劑盒不亂性無顯著改變。研制的ELISA試劑盒為PRRSV臨床血清抗體檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。該試劑盒對350份臨床疑似血清檢出率為88.6%。擴大誘導(dǎo)培養(yǎng),收集菌體,提取包涵體,用GST-Protein Purtification Kit親和層析純化目的蛋白,SDS-PAGE電泳檢測純度達到90%以上,可知足診斷抗原質(zhì)量要求。ELISA試劑盒批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為3.44%～6.34%和5.04%～7.64%。優(yōu)化后抗原zui適包被質(zhì)量濃度為2.5mg/L;血清zui適稀釋度為1∶100;對血清樣本檢測臨界值為0.224;特異性為95%,敏感性為90%;與豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒等常見豬繁殖障礙病尺度陽性血清無交叉反應(yīng)。ELISA試劑盒用純化PRRSV重組核衣殼蛋白GST-N為包被抗原,建立檢測PRRSV血清的間接ELISA診斷方法,并組裝ELISA試劑盒。

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