大鼠原代細(xì)胞分離是指將組織分散制成細(xì)胞懸液后從中獲取目的細(xì)胞的過程，獲得高純度、高活性的大鼠原代細(xì)胞則是很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵要素之一，大鼠原代細(xì)胞分離的方法有很多種：懸浮離心法、直接組織塊法、酶消化法、非酶消化法、機(jī)械分散法等。

人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，即使采用1mm3 的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng)，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來，常采用的方法如下：

一、懸浮細(xì)胞的分離方法

組織材料若來自血液、 羊水、胸水或腹水的懸液材料方法是采用 1000r/min 的低速離心 10 分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂 PBS 洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)?，?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。

二、實(shí)體組織材料的分離方法

對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，大鼠原代細(xì)胞為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。

(一)機(jī)械分散法

所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號(hào)針)，使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

(二)消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀)，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

消化分離法的操作步驟

1)剪切把組織塊剪碎，呈 1~5mm3 大小的組織塊。

2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂 PBS 洗 2-3 次(采用傾斜，自然沉降法)。

3)消化 加入消化液 (膠原酶或 EDTA )于 37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間 (中間可輕搖 1~2 次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入培養(yǎng)基。

6)機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使大鼠原代細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或 3~4 層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降 5~10 分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)如下

1)組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清和 EDTA 的抑制作用。

2)胰蛋白濃度不宜過高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。

3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失

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