做過原代細(xì)胞的人都知道，實(shí)驗(yàn)看似容易，但真想把結(jié)果做漂亮，還是需要花上很長一段時(shí)間去積累和摸索經(jīng)驗(yàn)。很多人剛開始啥也不懂，一味按照網(wǎng)上操作流程來做，但做的結(jié)果往往并不是十分理想，終結(jié)果未能達(dá)到預(yù)期的效果。就來給大家分享下原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中會(huì)會(huì)遇到的問題以及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。

一、石蠟切片和冰凍切片的區(qū)別是什么？

 1.冰凍切片常用于手術(shù)中的快速病理診斷，優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做原代細(xì)胞時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。

2.石蠟切片廣泛應(yīng)用于常規(guī)制片，優(yōu)點(diǎn)是可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫長久保存。缺點(diǎn)是步驟繁多，需要抗原修復(fù)。

3.抗體應(yīng)用中能做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)槭炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是能做石蠟切片的，可同時(shí)做冰凍切片。

二、如何才能充分脫蠟？

 1.蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須脫蠟，原代細(xì)胞目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；

2.脫蠟的時(shí)間要靈活調(diào)整。如果在夏天，室溫較高，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5 min 就已足夠。如果在冬天，室溫較低，則脫蠟時(shí)間需要延長，10-20 min 或更長。

3.當(dāng)天切的切片，烤 2 小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫 10-20 min，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果會(huì)更好。

三、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？

1.一般 3% 過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以避光 10 min；而 0.3% 過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間，一般 10-30 min。

2.用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS 好，能更好保護(hù)抗原和固定組織，過氧化氫孵育時(shí)間過長易引起脫片。

3.現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4oC 避光保存。

四、蘇木素復(fù)染時(shí)間如何把握？

1.蘇木素復(fù)染時(shí)間要根據(jù)溫度，試劑新舊和目標(biāo)物的定位變動(dòng)，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。對(duì)于細(xì)胞核定位的指標(biāo)，減少蘇木素染色時(shí)間。

2.鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（動(dòng)作一定要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。

3.如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。

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