在一步法測定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物".類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,此時反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2,圖1-4),如按常法測讀,所得結(jié)果將低于實際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),因為標(biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落.鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時,反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果.因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)時,應(yīng)注意可測范圍的值.用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng).

      假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物.但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4個亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題.

       雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾.RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合.用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽性反應(yīng).采用F(ab')或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾.雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標(biāo)(參見6.2).

       雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心.