在運(yùn)用ELISA方法測(cè)定抗體方面，通常所用的方法稱為間接法，也是目前zui常用的方法，其原理：間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，(對(duì)人的標(biāo)本來說即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測(cè)抗體的量，其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定。
操作步驟：
1.將抗原按5 μg/ml稀釋于碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)，100 μl /孔，4℃過夜。
2.次日PBS-T清洗4次(快1慢3，間隔5分鐘)。
3.加2%BSA封閉室溫1 h，200 μl /孔。
4.陽性對(duì)照從10ug/ml，做倍必稀釋，待測(cè)血清從1：50做倍比稀釋，預(yù)試驗(yàn)后確定稀釋倍數(shù)及陽性對(duì)照的起始濃度及稀釋數(shù)量(以可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線為參數(shù))，室溫1h。
5.PBS-T清洗4次(快1慢3，間隔5分鐘)。
6.加入1：3000(不同公司有不同的推薦稀釋度) PBS-T稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG，100 μl /孔，室溫1h。
7.PBS-T清洗4次(快1慢3，間隔5分鐘)。
8.顯色，100 μl /孔，顏色變深后中止顯色，2M硫酸在BIO-RAD酶標(biāo)儀上讀數(shù)，可用ABTS，OPD，TMB等。
ELISA方法檢測(cè)指標(biāo)我們需要在細(xì)節(jié)上多注意，這樣我們得出的指標(biāo)會(huì)準(zhǔn)確的很多。
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