一、實驗?zāi)康呐c要求：
（1） 熟悉玻璃器皿的洗滌包裝和滅菌前的準(zhǔn)備工作。
（2） 學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)基和無菌水的制備，了解培養(yǎng)基配方中各成分的作用、制備流程及各環(huán)節(jié)的操作技術(shù)與應(yīng)用。
（3） 學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。
二、實驗原理
培養(yǎng)基的制備原理
培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個良好的營養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場所。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實驗和研究上的目的不同，所以培養(yǎng)基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育的水分、碳源、氮源、無機鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度（pH值）和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。
根據(jù)制備培養(yǎng)基對所選用的營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基三類。按照培養(yǎng)基的形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基使用目的，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。
培養(yǎng)基的類型和種類是多種多樣的，必須根據(jù)不同的微生物和不同的目的進行選擇配制，本實驗分別配制常用培養(yǎng)細菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基。
固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂zui為常用，其主要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)（25℃-37℃）不會融化而保持固體狀態(tài)。
高壓蒸氣滅菌原理
高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表Ⅴ-2），二是濕熱的穿透力比干熱大（表Ⅴ-3）；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2.26kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
表Ⅴ-2 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系

在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否*極為重要，因為空氣膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系見表Ⅴ-4。一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm2，121.3℃ 15-30分鐘可達到*滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.56kg/cm2（8磅/英寸2），112.6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3℃，20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以1.05kg/cm2，121.3℃滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶內(nèi)的培養(yǎng)基以1.05kg/cm2滅菌30分鐘。
蒸汽壓力所用單位為kg/cm2（千克/厘米2），它與1b/in2（磅/英寸2）和溫度的換算關(guān)系見表Ⅴ-5。
 

三、實驗器材
1、 藥品 瓊脂，10％HCL,10% NaOH，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方藥品；
2、 材料 具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，電子稱，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報紙，麻繩，標(biāo)簽，培養(yǎng)皿。
3、 設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等
四、實驗步驟
1、 稱取藥品放在大燒杯中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌并加熱溶化，等藥品溶解后用pH試紙調(diào)節(jié)p H至7.4-7.6，如有沉淀應(yīng)過濾后分裝，每支試管約加入9ml。每組分裝30支，加上棉塞，包上牛皮紙，準(zhǔn)備滅菌。
裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。
2、無菌水準(zhǔn)備
在試管或瓶內(nèi)先盛以適量的蒸餾水〔或生理鹽水O．85％NaCl），蓋好棉塞，包上牛皮紙使其滅菌后，其水量恰為9ml。 每組準(zhǔn)備10支與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可放在同一試管架上，以一大張牛皮紙包扎寫上姓名。準(zhǔn)備滅菌。
3、高壓滅菌
手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟：
（1）首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。
（2）放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
（3）加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。
（4）用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)的冷空氣。待冷空氣*排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2，121.3℃，20分鐘滅菌。
（5）滅菌所需時間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。
（6）將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。