影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性、檢驗(yàn)標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物，操作過程中的問題。上?？婆d就這一原因作一簡要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度，從而提高檢測的特異性，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管 三種，以微量滴定板zui為常見[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板 型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證，評(píng)估。
1、2包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體 的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1、3包被抗體 的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。
1、4 封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2]，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2、1內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體，多數(shù)為IgM類，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng)，從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
2、2 外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等。溶血標(biāo)本，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2]，有國內(nèi)報(bào)道酶免HAg試劑檢測溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心，在冰箱中保存不易過久。標(biāo)本凝集不全時(shí)，血清 中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽性。
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