實(shí)驗(yàn)試劑
DMEM培養(yǎng)基
胎牛血清
PBS
BD24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
Raininpipettips,1ml
戊二醛
乙醇
結(jié)晶紫
細(xì)胞培養(yǎng)儀：37°Cand5%CO2
人MDA-MB-231cell
1. 細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
2. 細(xì)胞以一定密度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，生長(zhǎng)24小時(shí)后，單層細(xì)胞融合度應(yīng)達(dá)到70-80%。
3. 不要更換培養(yǎng)基。用新的1ml槍頭輕輕的在單層培養(yǎng)細(xì)胞間劃痕，劃痕橫穿過(guò)孔，槍頭盡量與板孔的底部垂直，不要傾斜。這樣產(chǎn)生的gap的距離才與槍頭末端的外直徑相等。Gap的距離可以選用不同型號(hào)的槍頭調(diào)節(jié)。劃痕在同一方向成一條直線。
4. 在垂直與*條劃痕的方向制作另一條劃痕，每孔劃痕成十字交叉型。
5. 劃痕后，用培養(yǎng)基輕輕的清洗板孔2次，以去除脫落細(xì)胞。
6. 每孔添加新鮮培養(yǎng)基。
7. （培養(yǎng)基中含有某些成分，如抑制/促進(jìn)細(xì)胞遷移和/或增殖的化學(xué)物質(zhì)）。
8. 細(xì)胞生長(zhǎng)48小時(shí)（或根據(jù)時(shí)間需要）。
9. 1xPBS清洗細(xì)胞兩次，然后使用3.7%多聚甲醛固定30分鐘。
10. 0.1%的結(jié)晶紫（2%乙醇溶解）染色30分鐘。
11. 染色的單層細(xì)胞選取不同的視野，顯微鏡拍照。gap的距離可通過(guò)Photoshop或ImagJ軟件測(cè)量.為了降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可變性，建議每孔選擇多個(gè)視野觀察，每組做多個(gè)重復(fù)。
?孔??pˊ????后15分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。
12. 計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。zui終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
1. 樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因?yàn)榀B氮鈉（NaN3）是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的抑制劑。
2. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能立即試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。
4. 實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。
5. 酶標(biāo)包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。
6. 建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照都做雙份檢測(cè)，取平均值，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。
7. 牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計(jì)算結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。
8. 本試劑盒定量范圍為20-640ng/L，超過(guò)此范圍，為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計(jì)算所得，不做為準(zhǔn)確定量結(jié)果，請(qǐng)用特殊稀釋液稀釋后測(cè)定準(zhǔn)確結(jié)果（20-640ng/L范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。
9. 若顯色過(guò)淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)底物溫育時(shí)間。
10. 為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照每加一個(gè)就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、*和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。
11. 試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號(hào)的試劑不得混用。
12. 底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。
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