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原代細(xì)胞的分離和制作的消化分離法的操作步驟

閱讀：551發(fā)布時(shí)間：2015-5-21

（1）剪切把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。
（2）加液漂洗將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。
（3）消化加入消化液（*或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。*消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。
（4）棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培養(yǎng)基。
（6）機(jī)械分散采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)如下：
（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)*和EDTA的抑制作用。
（2）胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用。

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。


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