ELISA試劑盒利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，可分為直接法、間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法等。針對(duì)間接法，我公司技術(shù)員做出了*經(jīng)驗(yàn)講談：
*、方陣ELISA
1.用途：
① 融合前后確定鼠血清中抗體效價(jià)；
② 拿到單抗腹水后，需要建立ELISA方法時(shí)首先要確定包被原及抗體的*工作濃度。
經(jīng)典的方陣ELISA：將抗原和抗體各自稀釋成不同梯度濃度，結(jié)果OD值P/N>2的均判為陽性，選取OD值在1.0左右的那個(gè)Ag-Ab濃度為*工作濃度，其主要原因與酶標(biāo)儀靈敏度有關(guān)。
但是，對(duì)于抗原抗體而言，由于它們被稀釋成不同濃度，那么在理論上，每個(gè)抗原稀釋度情況下，總有一個(gè)抗體的稀釋度其OD值在1.0左右，那么到底選取哪一個(gè)OD值1.0左右的好呢？這就需要同時(shí)用藥物做個(gè)抑制來看，哪個(gè)濃度下抑制情況好，就取哪個(gè)抗原抗體濃度做工作濃度。
第二、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA
在用方陣ELISA確定好抗原抗體*結(jié)合濃度后就可以做間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA了，其目的主要是考察抗體的特異性、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算抗體對(duì)抗原的半數(shù)抑制、檢測(cè)限等參數(shù)，也可以用來檢測(cè)未知樣品中的抗體。方法是用確定的抗原包被，在加一抗時(shí)同時(shí)加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后加二抗，顯色。用藥物(即標(biāo)準(zhǔn)品)濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)，繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)的參數(shù)，之后就可以將未知的樣品所測(cè)OD值代入曲線方程求其中抗體的含量。通常這是建立ELISA檢測(cè)方法的*項(xiàng)目。
標(biāo)準(zhǔn)曲線可以繪成直線或是曲線(二次方程或三次方程)。通常是選取線性比較好的幾個(gè)點(diǎn)繪成直線。直線斜率越高說明抗體的特異性及靈敏性好，R2值越靠近1，則說明線性關(guān)系好。曲線繪好后，有一些常用的參數(shù)，如抑制率、半數(shù)抑制、檢測(cè)限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)等等：
1.抑制率(%)＝1－B/B0(B0為不含藥物的OD值；B為含有藥物的OD值)
2.標(biāo)準(zhǔn)差(SD)＝[∑(Xi－B)2/(n－1)]1/2；
3.標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＝SD/B
半數(shù)抑制：指用藥物(半抗原)去做競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)時(shí)呈現(xiàn)50%抑制效果時(shí)的藥物濃度。藥物濃度越低，而抑制率越高，則表示抗體對(duì)藥物的特異性越好，靈敏度也高。
半數(shù)抑制濃度IC50對(duì)應(yīng)的OD值：OD IC50＝0.5 B0
檢測(cè)下限(LOD)對(duì)應(yīng)的OD值：ODLOD=B0－3SD；
定量限(LOQ)對(duì)應(yīng)的OD值：ODLOQ=B0－10SD
第三、間接ELISA操作中具體注意的問題
間接ELISA一般有6個(gè)步驟：包被抗原、封閉、加一抗(在做競(jìng)爭(zhēng)時(shí)同時(shí)加入藥物)、加二抗、顯色、終止。其中除了加顯色和終止外，其余步驟之間都要進(jìn)行洗板。在這里面，每一步都非常重要，假如有一步疏忽都會(huì)造成ELISA試劑盒結(jié)果的不準(zhǔn)確。通常ELISA結(jié)果會(huì)出現(xiàn)如空白顯色、陰性偏高、方陣梯度不明顯，還有如何提高間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA靈敏度等問題。
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