DNA測(cè)序是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)關(guān)鍵性發(fā)現(xiàn)的推動(dòng)力。比如，一個(gè)人基因組的全部序列為醫(yī)學(xué)診斷和醫(yī)療保健提供重要的標(biāo)記物和指導(dǎo)方針。盡管過去10年已取得眾多進(jìn)步，但是當(dāng)前大多數(shù)高通量測(cè)序儀器都是依賴于光學(xué)技術(shù)來檢測(cè)DNA的四個(gè)結(jié)構(gòu)單元：A、C、G和T。為了進(jìn)一步提高測(cè)量能力，科學(xué)家們已開發(fā)出電子DNA測(cè)序（electronic DNA sequencing）技術(shù)來對(duì)一組DNA模板進(jìn)行測(cè)序。zui近，科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)在施加的電流的作用下，DNA能夠穿過蛋白納米孔（protein nanoscale pore）從而在單分子水平上產(chǎn)生電子信號(hào)。然而，四個(gè)核苷酸堿基在化學(xué)結(jié)構(gòu)上非常相似，利用這種技術(shù)很難將它們區(qū)別開來。因此，研究和開發(fā)一種單分子電子DNA測(cè)序平臺(tái)是一個(gè)zui為活躍的研究領(lǐng)域，而且有潛力產(chǎn)生一種手持的DNA測(cè)序儀：它能夠破譯基因組從而有助于開展個(gè)人化醫(yī)學(xué)治療和基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究。
來自美國哥倫比亞大學(xué)的一個(gè)研究小組（由哥倫比亞大學(xué)基因組技術(shù)與生物分子工程中心主任、化學(xué)工程與藥物學(xué)教授Jingyue Ju博士領(lǐng)導(dǎo)）和來自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST）的研究人員（由美國物理學(xué)會(huì)成員John Kasianowicz博士領(lǐng)導(dǎo)）開發(fā)出一種能夠區(qū)分單個(gè)堿基的新方法來潛在地在單分子水平上利用納米孔進(jìn)行電子DNA測(cè)序。相關(guān)研究論文于9月21日在線刊登在Scientific Reports期刊上。在這項(xiàng)研究中，研究人員報(bào)道的這種基于納米孔的邊合成邊測(cè)序（nanopore-based sequencing by synthesis, Nano-SBS）的策略通過檢測(cè)4種不同大小的標(biāo)記而能夠在單分子水平上準(zhǔn)確地區(qū)分4種DNA堿基，其中這4種標(biāo)記是從用于序列測(cè)定的5’-磷酸修飾的核苷酸（5'-phosphate-modified nucleotide）上釋放出來的。
Nano-SBS策略的基本原理如下所示。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）期間，當(dāng)每個(gè)核苷酸類似物被整合進(jìn)正在延長的DNA鏈時(shí)，由此形成的磷酸二酯鍵讓它所攜帶的標(biāo)記釋放出來。這些標(biāo)記物將按照釋放的順序進(jìn)入納米孔，并根據(jù)它們不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生各自*的離子電流阻塞特征（ionic current blockade signature），因而能夠利用電子手段在單分子水平上區(qū)分單個(gè)堿基并確定DNA序列。為了驗(yàn)證這個(gè)原理，研究人員附著4種不同長度的聚合物標(biāo)記到2’-脫氧腺苷-5’-四磷酸（2'-deoxyguanosine-5'-tetraphosphate, 即前面所述的5’-磷酸修飾的核苷酸，是一種核苷酸類似物）的末端磷酸基團(tuán)上，并證實(shí)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，這些核苷酸類似物能夠被有效地整入到DNA鏈中，而且基于它們各自*的納米孔離子電流阻塞特征能夠更好地在單分子水平上對(duì)這四種標(biāo)記進(jìn)行基準(zhǔn)線區(qū)分。這種方法與附著到以矩陣形式排布的納米孔的聚合酶結(jié)合在一起就應(yīng)當(dāng)能夠構(gòu)建出單分子電子Nano-SBS平臺(tái)。
在之前由Ju教授與Nicholas J. Turro博士領(lǐng)導(dǎo)的一項(xiàng)研究中， 哥倫比亞大學(xué)基因組技術(shù)與生物分子工程中心利用可裂解的熒光核甘酸可逆性末端終止（cleavable fluorescent nucleotide reversible terminator; nucleotide reversible terminator, NRT）開發(fā)出四色邊合成邊測(cè)序（four-color DNA sequencing by synthesis; sequencing by synthesis, SBS）平臺(tái)。利用可裂解的熒光核甘酸可逆性末端終止（NRT）進(jìn)行邊合成邊測(cè)序（SBS）是一種用于下一代DNA測(cè)序系統(tǒng)中的主導(dǎo)方法。
Kasianowicz博士和他的NIST研究團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)性地研究了用于單分子分析的納米孔。他們之前報(bào)道了不同長度的聚合物（即聚乙二醇, polyethylene glycol, PEG），能夠通過它們?cè)趩畏肿铀缴蠈?duì)α-溶血素（α-hemolysin）蛋白納米孔中的電流讀數(shù)的*影響而被區(qū)別開來?；诖?，他們隨后為當(dāng)前這項(xiàng)研究中的電子DNA測(cè)序方法給出理論上的支撐。將SBS概念與*的納米孔可檢測(cè)的用來標(biāo)記DNA結(jié)構(gòu)單元的電子標(biāo)簽（electronic tag）結(jié)合起來就導(dǎo)致研究人員開發(fā)出當(dāng)前這項(xiàng)研究中描述的單分子電子Nano-SBS方法。
正如論文*作者Shiv Kumar博士指出的那樣，“我們的方法新穎之處在于設(shè)計(jì)和使用4種不同標(biāo)記的核苷酸，并且這些不同標(biāo)記的核苷酸一旦被DNA聚合酶整入到DNA鏈上就會(huì)釋放4種不同大小的標(biāo)記，接著當(dāng)這4種標(biāo)記通過納米孔時(shí)，它們就能夠在單分子水平上被相互區(qū)分開來。這種方法就克服了DNA四個(gè)堿基之間的小差別所帶來的任何限制，這些限制也是當(dāng)前大多數(shù)納米孔測(cè)序方法幾十年來所面臨的挑戰(zhàn)。”再者，這種技術(shù)是相當(dāng)靈活的；利用PEG標(biāo)記作為原型，人們也能夠選擇其他的化學(xué)標(biāo)記來在不同納米孔系統(tǒng)中提供*的分離。
隨著進(jìn)一步開發(fā)這種Nano-SBS方法，如使用大型蛋白或固態(tài)納米孔矩陣，這種系統(tǒng)有潛力準(zhǔn)確地、快速地和低成本低地對(duì)整個(gè)人類基因組進(jìn)行測(cè)序，從而使得它能夠用于常規(guī)性醫(yī)學(xué)診斷。
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