ELISA檢測試劑盒酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。該技術(shù)所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。
一、酶和酶作用的底物
1.辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP對受氫體的專一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H202方便。
2.堿性磷酸酶（AP）：ELISA試劑盒是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般采用對**苯***（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。ELISA試劑盒產(chǎn)物為黃色的對**酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時間。
二、酶標(biāo)記抗體或抗原
酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）。抗原由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合，如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。
1.戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法l0倍左右。
2.過碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用***鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。
按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中zui后的酶活性測定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。
3.標(biāo)記抗體鑒定：通常采用棋盤滴定法進(jìn)行篩選，見第十九章。
三、ELISA檢測試劑盒固相載體
酶免疫技術(shù)的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物?？勺鞴滔噍d體的物質(zhì)很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式，在測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。
四、免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。ELISA檢測試劑盒將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA試劑盒ELISA板孔中在4℃夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，ELISA試劑盒其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。
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