50%溶血試驗(yàn)(CH50)測(cè)定補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)
50%溶血試驗(yàn)即求得能使50%致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的zui小量血清，然后計(jì)算出每毫升血清中補(bǔ)體含量。
以補(bǔ)體量作為橫坐標(biāo)，溶血百分?jǐn)?shù)作為縱坐標(biāo)，可得到一個(gè)清晰的“S”形曲線。在50%溶血周圍，線段近似一條直線。因此當(dāng)補(bǔ)體用量稍有變動(dòng)，就可對(duì)溶血程度發(fā)生很大影響。所以用50%溶血作為終點(diǎn)要比100%溶血更為敏感。
50%溶血試驗(yàn)定血清中補(bǔ)體含量用以下公式表示：每毫升血清中補(bǔ)體含量(單位)=(1/血清用量)×稀釋倍數(shù)。
該公式可以從Von Krogh 方程式進(jìn)一步加以論證：x=k[1/(1-y)]1/n。假定X=加入的新鮮血清量，y=溶血的百分率，以小數(shù)表示，V=斜率，k=常數(shù)，轉(zhuǎn)變成對(duì)數(shù)，上述公式就變成：logx=logk+1/n log[y/(1-y)]，當(dāng)以50%溶血作為終點(diǎn)時(shí)，y/(1-y)=0.5/(1-0.5)=1，代入上述公式，log x=log k+1/n log1，由于-log1=0，log x=log k，x=k，也即表示補(bǔ)體的50%溶血單位k就是加入的新鮮血清量。
材料及器材
1、稀釋液(磷酸鹽*)：
NaCl 17g
Na2HPO4 11g
KH2PO4 0.27g
蒸餾水 100ml
使用時(shí)取此原液50ml，加90ml蒸餾水，經(jīng)高壓滅菌后即可使用。加入100%*鎂溶液1ml，可增強(qiáng)補(bǔ)體的效能；
2、綿羊紅細(xì)胞懸液(1×10g/ml)；
3、溶血素(2U)；
4、被檢血清(新鮮豚鼠血清)；
5、水平離心機(jī)；
6、水浴箱；
7、721型分光光度計(jì)。
方法
1、濃度為1×10g/ml的綿羊紅細(xì)胞配制 取經(jīng)稀釋洗滌后的綿羊紅細(xì)胞配成較5%稍濃的細(xì)胞懸液。取50%細(xì)胞懸液1ml，加于14ml蒸餾水中測(cè) O.D值為DI按下式求出于一定體積的5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋液的毫升數(shù)。
Vf=Vi(Di-Ds)/Ds，Vi為配制的50%細(xì)胞懸液體積，Vf為于一定量5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋的ml數(shù)Ds為已知標(biāo)準(zhǔn)化的1×100個(gè)細(xì)胞/ml懸液的OD540值-0.385。
2、致敏綿羊細(xì)胞 取綿羊紅細(xì)胞懸液(1×102/ml)加等量的溶血素(2U/ml)。充分混合。置37℃水浴中作用30分鐘，每隔10分鐘搖動(dòng)一次以免細(xì)胞下降即成5×108/ml致敏羊紅細(xì)胞。
3、補(bǔ)體CH50單位測(cè)定
(1)按下表加樣；
(2)將各管充分混合，置37℃水浴中60分鐘(搖動(dòng)1～2次，以免紅細(xì)胞下沉)；
(3)從水浴中取出后，立即將各管以2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，將各管上清液分別移于另一試管；
(4)測(cè)定各管上清液OD值(波長(zhǎng)＝540nm)。
4、補(bǔ)體CH50單位的計(jì)算 從測(cè)定管(第1～5管)及溶血對(duì)照管(第6管)的OD值中減去紅細(xì)胞對(duì)照管(第7管)的OD值。再減去按待測(cè)血清每管實(shí)際用量計(jì)算出的血清色度OD值(80/800ⅹ該管實(shí)際量ⅹ第8管OD值)。即為測(cè)定管的校正OD值。然后計(jì)算各測(cè)定管的溶血率(y值)，再計(jì)算各管的y/(1-y)值。在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以y/(1-y)值為橫坐標(biāo)，血清用量為縱坐標(biāo)，得到一條直線。由于50%溶血(y=0.5)的y/(1─y)值等于1。即可由橫坐標(biāo)等于1的一點(diǎn)，在直線上求得在縱坐標(biāo)上相應(yīng)的截距，此即產(chǎn)生50%溶血的待測(cè)血清實(shí)際用量。zui后，按下列公式計(jì)算出每毫升待測(cè)血清的總補(bǔ)體活性，以單位/毫升表示之。
50%溶血試驗(yàn)(CH50)測(cè)定補(bǔ)體實(shí)驗(yàn)
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