引物純度的檢測和濃度的計算
閱讀：6450發(fā)布時間：2011-11-16
引物純度的檢測
實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95℃,2mins）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后（約2-3小時），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB染色或銀染方式染色。而有的廠家提供Maldi-TOF質(zhì)譜QC質(zhì)量控制，從而保障了合成的準確率：
Bioneer使用多重Maldi-TOF質(zhì)譜儀進行全自動裝載及監(jiān)測。每份樣品的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)將自動插入到寡核苷酸的信息單中。Bioneer是世界上僅有的幾個對生產(chǎn)的每份核苷酸（單個寡核苷酸和高通量和成）都用MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測進行核苷酸QC檢測的廠商，而且免費提供質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
引物不純可能會導致：1）非特異性擴增；2）無法用預先設計在引物5′端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護堿基的引物；3）用于測序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。
引物濃度的計算
引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。一般情況下，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計算：V（微升）=OD數(shù)*（乘）33*（乘）*（乘）20000/（除）引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。
注意：1OD260=33ug/ml.
