果蠅類標(biāo)本的辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑染色檢測操作步驟
（1）樣品洗畢后（見前），懸于含1％正常羊IgG的PBS中。在1．5ml錐形管中胚胎或其他樣品所占體積應(yīng)少于50txl，或在5mlsnap-top管中應(yīng)少于200／A。搖動孵育1h。
（2）用PBS洗2次。
（3）加一抗：用含蛋白質(zhì)的溶液，如含羊IgG的PBS制備不同稀釋度的抗體。單克隆抗體來自雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清（特異性抗體濃度為20—50ug／m1；以1：10稀釋度作起點(diǎn)為佳）。小鼠腹水或純化的單克隆抗體和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應(yīng)測試一定范圍內(nèi)的稀釋度，從而使特異性抗體濃度達(dá)到0．01—1Pg／ml。如果特異性抗體濃度是未知的，應(yīng)制備并測試原始制品的不同稀釋度（1：10，1：100，1：1000和1：10000）。
（4）在4℃孵育24h。果蠅類標(biāo)本的辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑染色檢測操作步驟
（5）用PBS洗3次，每次5min以上。PBS緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以降低背景。
在此方法中，以未免疫的羊IgG作為封閉劑，即從正常羊血清中通過蛋白G純化制備。因本文推薦的標(biāo)記二抗是羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白抗體，故選擇羊IgG作為封閉試劑。如使用的是另一來源的標(biāo)記二級試劑，則應(yīng)改用其他封閉劑，如可選用3％牛血清白蛋白。
（6）加標(biāo)記的二級試劑：用含蛋白質(zhì)的溶液，如1％正常羊IgG／PBS制備不同稀釋度的二級試劑。常用的二抗試劑包括抗免疫球蛋白抗體、蛋白A或蛋白G。一般而言，建議使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白二抗。標(biāo)記的二級試劑可以購自供應(yīng)商，如使用商業(yè)來源的標(biāo)記二級試劑，其稀釋度可從1：50至1：1000。堿性磷酸酶標(biāo)記的試劑應(yīng)用Tris緩沖液稀釋，而不用PBS。
（7）加標(biāo)記的二抗試劑，4℃孵育1h。果蠅類標(biāo)本的辣根過氧化物酶標(biāo)記試劑染色檢測操作步驟
（8）用PBS洗3次，每次5min以上。PBS中可以含1％TritonX-100或NP-40，降低背景。
（9）將6mgDAB溶解在9m10．05mol／LTris緩沖液中（pH7．6）。
（10）加入lml 0．3％（W／V）氯化鎳貯液，也可用等量的氯化鈷替代。
（11）加0．1ml 3％*（用水配制），通常供應(yīng)的過氧化氫為30％，4℃下可保存1個月左右。
（12）如果有沉淀出現(xiàn)，可用Whatmanl號濾紙（或相應(yīng)的）過濾。
（13）將底物溶液加至樣本中，孵育1—20min，用水沖洗終止反應(yīng)。在顯微鏡下觀察顏色的變化以便判斷終止反應(yīng)的適當(dāng)時間。
（14）優(yōu)化選擇：在高倍鏡下觀察胚胎時，胚胎的直觀視覺模式和通過胚胎的光路長度常引起標(biāo)本出現(xiàn)不透明的現(xiàn)象。為了克服這一特點(diǎn)，通常用不同的試劑處理胚胎，這樣將能改變胚胎的折射指數(shù)?？蓪⑴咛ピ诟视突蚣谆畻钏猁}溶液中孵育。對于大多數(shù)染色標(biāo)本以甘油效果較好。
將胚胎重懸于500弘l的甘油／PBS（50：50）混合液中，于室溫下孵育1h。
離心胚胎，重懸于70：30的甘油／PBS混合液中。
經(jīng)過甲基水楊酸鹽溶液處理的標(biāo)本清晰度比甘油更好，但它易揮發(fā)，使一些工作者難于忍受這種氣味。此外，它沒有黏度，使得對胚胎的處理較容易。可先將胚胎通過一系列乙醇處理：50％l醇5min，70％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇5min，各2次。再加500~1甲基水楊酸鹽溶液，作用10min，不應(yīng)搖動試管。胚胎將沉到底部。去除上清并加新鮮的甲基水楊酸鹽溶液。zui后用甘油代替甲基水楊酸鹽溶液。
（15）樣品觀察：將用甘油洗過的樣品轉(zhuǎn)到玻片上。在解剖顯微鏡下觀察胚胎，并挑選一部分在高倍鏡下檢查。
在一潔凈的載玻片上放2張蓋玻片（井1），中間間隔lcm，以準(zhǔn)備一個觀察小室。在這間隔區(qū)加上70：30的甘油／PBS溶液。由于毛細(xì)作用就可以使該溶液進(jìn)入蓋玻片下。將所研究的胚胎轉(zhuǎn)至該觀察區(qū)，并蓋上第3張蓋玻片。應(yīng)避免氣泡的形成。來回推蓋玻片，以便尋求到*方向進(jìn)行觀察。
（16）觀察并照相。
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