斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
Hawkes等（1982）根據(jù)某些固相載體具有較強(qiáng)吸附蛋白質(zhì)能力的特點(diǎn)，研究建立了斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA），目前在醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)工作中得以廣泛應(yīng)用。該試驗(yàn)以硝酸纖維素薄膜（NC）作固相載體，代替了聚苯乙烯反應(yīng)板，從而克服了ELISA方法中包被好的酶標(biāo)板保存運(yùn)送不便及檢測(cè)需儀器等缺點(diǎn)，在1cm2大的薄膜上即可檢測(cè)1份樣品，且其操作簡便，即在NC膜上依次滴加標(biāo)本液（待測(cè)的抗體或抗原）、已知抗原（抗體）、酶結(jié)合物，作用一定時(shí)間后，加底物顯色，出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)者為陽性，無色者為陰性。
因建立Dot-ELISA的原理與常規(guī)ELISA相同，故常規(guī)ELISA可用Dot-ELISA代替，用于抗原、抗體的定性和定量等方面的檢測(cè)。
斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
硝酸纖維素膜是很好的固相載體，故Dot-ELISA有以下優(yōu)點(diǎn)：①吸附力強(qiáng)，在中性緩沖液條件下，一般蛋白質(zhì)包括某些不易被酶標(biāo)板吸附的大分子及核酸都能被膜吸附；②同時(shí)可測(cè)幾種抗體（抗原）。把幾種抗原或不同血清型的幾種抗原包被在一條薄膜上，便可同時(shí)測(cè)定一份樣品中的幾種抗體。這是ELISA所不及的；③做試劑盒。酶標(biāo)板體積大，包被后，需4℃保存，運(yùn)送不便，不適于制試劑盒。而包被好的膜如同pH值試紙，體積微小，攜帶方便，常溫干燥可保存一個(gè)月，操作簡便，目測(cè)判定結(jié)果比ELISA方便。故zui適于做各種試劑盒；④快速，一般在4小時(shí)內(nèi)可獲得測(cè)定結(jié)果。
斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
需要注意的是，在正式測(cè)樣品之前，需認(rèn)真做好Dot-ELISA標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)備實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括：①確定酶結(jié)合物*稀釋度。一般以陰性樣品不顯色而陽性樣品顯色zui強(qiáng)的酶結(jié)合物稀釋度為*稀釋度。②確定*包被濃度。包被濃度過高或過低都會(huì)使顯色減弱、靈敏度下降。③底物顯色的*條件。在ELISA方法中，辣根過氧化物酶反應(yīng)的*pH值在5.6左右，而在Dot-ELISA方法中，如以鹽酸聯(lián)苯胺和過氧化氫為底物時(shí)，無論以何種緩沖液配制，加底物后，溶液pH值應(yīng)在 5.8～6.0，此時(shí)反應(yīng)zui靈敏，強(qiáng)陽性出現(xiàn)藍(lán)黑色斑點(diǎn)，弱陽性出現(xiàn)淡綠色斑點(diǎn)。當(dāng)pH值＞6.5時(shí)斑點(diǎn)顯色為棕黃色，靈敏度稍低。當(dāng)pH值過高時(shí)，因過氧化氫自動(dòng)氧化而顯色減弱。當(dāng)pH值過低時(shí)，底物生成可溶性沉淀，斑點(diǎn)退色。斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
Dot-ELISA在測(cè)定不同的樣品時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果不同，只有在確定了每一步的*反應(yīng)條件后，才能充分發(fā)揮本方法靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
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