熒光染料定量DNA
1. 應(yīng)用說明
在分子生物學(xué)的許多試驗(yàn)中，DNA定量都是一個(gè)很重要的步驟。用到DNA的常用技術(shù)有序列分析、cDNA合成和克隆、RNA轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染、核酸標(biāo)記（比如隨機(jī)引物標(biāo)記）等等，這些試驗(yàn)的好壞取決于所使用模板濃度，對(duì)所用DNA模板濃度錯(cuò)誤估計(jì)往往是導(dǎo)致這些實(shí)驗(yàn)失敗的zui直接原因。
核酸的濃度通常用紫外，在260nm波長處，測(cè)吸光值獲得，檢測(cè)中的靈敏性會(huì)受到很高的背景干擾。Hoechst 33258，一種二苯甲亞胺DNA結(jié)合物，在檢測(cè)時(shí)會(huì)有比紫外激發(fā)更強(qiáng)的熒光產(chǎn)生，檢測(cè)更靈敏。它在紫外區(qū)（350nm）附近被激發(fā)，發(fā)射波在藍(lán)光區(qū)（450nm），檢測(cè)dsDNA的靈敏度是10ng/ml
2. 所需材料
●ModulusTM單管型多功能檢測(cè)儀
●紫外熒光模塊
●微量比色杯 和微量適配器 或比色杯
●Hoechst 33258 10 mg/ml
●10XTNE儲(chǔ)存緩沖液
●0.45μm的過濾水
3. 考慮因素
1 .DNA樣品中的AT含量會(huì)影響到Hoechst 33258-DNA熒光，因此，檢測(cè)樣品時(shí)設(shè)一對(duì)照是非常重要的，小牛胸腺DNA由于是雙鏈、高度聚合并含有大約58%的AT（42% GC）而經(jīng)常被用作動(dòng)植物DNA的對(duì)照。對(duì)于細(xì)菌DNA來說，它會(huì)有不同的對(duì)照，因?yàn)椴煌N的AT含量變化較大。
2. 不同構(gòu)造的質(zhì)粒DNA（超螺旋型、螺旋型、環(huán)形和、線型）會(huì)有不同的Hoechst 33258結(jié)合效果。因此，選擇一種與樣品特征相似的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照也是很重要的。
3. 在單鏈基因組DNA上的Hoechst 33258熒光只有在雙鏈基因組DNA上的一半，單鏈DAN片段的熒光量并不會(huì)與單鏈DAN的濃度成比例地引發(fā)熒光。
4. 用于全細(xì)胞DNA抽提的緩沖液對(duì)后期的檢測(cè)沒有什么影響。
5.少量的去污劑（＜0.01% SDS）對(duì)檢測(cè)也沒有什么影響。
6.含鹽濃度為3M NaCl的DNA抽提樣對(duì)檢測(cè)沒有影響。為獲得較強(qiáng)的熒光，純化的DNA樣品中至少要含有200mM的NaCl，未純化樣品中需含2.0-3.0M的NaCl。對(duì)于未純化樣品來講，較高的鹽濃度會(huì)將結(jié)合在DNA上的蛋白裂解下來，便于染料分子的結(jié)合。
7.RNA對(duì)檢測(cè)沒有影響，因?yàn)镠oechst 33258通常并不與RNA結(jié)合。來之于RNA的熒光信號(hào)通常會(huì)低于相同DNA濃度的1%。
4. 樣品檢測(cè)
1.熒光模塊的安裝
2.關(guān)掉多功能機(jī)電源開關(guān)，根據(jù)操作手冊(cè)插入紫外熒光模塊
3.打開電源開關(guān)，校準(zhǔn)前先預(yù)熱1min。
4.用于10X10mm比色杯的實(shí)驗(yàn)方案
5.準(zhǔn)備1ml 2000 ng/ml dsDNA標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)比色杯。
注：由于染料的加入，zui終濃度要小于起始濃度的1/2。另外也要考慮到起始樣品的稀釋。
5.使用微量比色杯的實(shí)驗(yàn)方案
將1mg/ml 的DNA儲(chǔ)存液用1倍TNE稀釋到2μg/ml，加相等體積的2倍的染料工作液，而后重復(fù)步驟4.4，充分混合。
注：用一個(gè)和檢測(cè)樣品濃度相同或相近的標(biāo)準(zhǔn)樣優(yōu)化系統(tǒng)，使檢測(cè)更。例如，若檢測(cè)樣品濃度在300 ng/ml，要用一個(gè)500 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)DNA樣。標(biāo)準(zhǔn)樣濃度應(yīng)該是與檢測(cè)樣濃度相同或超出100 ng/ml。
空白對(duì)照液制備。在另一只小離心管中加入相同體積的樣品緩沖液（通常是1倍TNE）和2倍的染料工作液。
混合小離心管中加有2倍染料工作液的樣品。
注：在微量比色杯中不要混合檢測(cè)樣、標(biāo)準(zhǔn)樣或有染料液的空白對(duì)照液。
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