ELISA實驗操作干貨

樣本如何處理、收集、保存？

1.細(xì)胞培養(yǎng)上清

細(xì)胞培養(yǎng)液在2500rpm/min 離心20分鐘后，收集上清即刻檢測， 或者分裝，-20℃貯存。避免反復(fù)凍融。

2．血清樣本

分離管分離血清。在1000g離心之前，使血樣凝集30分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃貯存。避免反復(fù)凍融。

3. 血漿樣本

EDTA、ghsn或肝素抗凝收集血漿樣本。在血樣收集3分鐘內(nèi)離心收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃貯存。避免反復(fù)凍融。注：不要使用嚴(yán)重溶血或高血脂的樣本。所有樣本收集后，應(yīng)及時分裝并貯存于-20℃。如果在24小時內(nèi)檢測，樣本可以存放在2 - 8℃。避免樣本的反復(fù)凍融。在分析前，冷凍樣本應(yīng)該緩慢的恢復(fù)至室溫，輕柔地混勻。檢測前，樣本中可見的沉淀必須去除。

已設(shè)陰性對照，還需空白對照嗎？

首先要清楚空白對照和陰性的區(qū)別：

空白對照：僅用稀釋液代替檢測樣本，用以觀察最終反應(yīng)的顯色“本底"，并用于酶標(biāo)儀消除、扣除“本底"，即以本底為“零’，讀取陽性、陰性對照孔和樣本孔的吸光值；

陰性對照：是本實驗檢測與待檢物有同源性和同質(zhì)性，又不含有待檢物質(zhì)，并能客觀比較和鑒別處理因素之間的差異。

出現(xiàn)白板，什么原因呢？

如果顯色完成后，肉眼可見整板沒有顯示反應(yīng)，可能原因及應(yīng)對方法詳見下表。

出現(xiàn)花板，什么原因呢？

花板是指空白、陰性、陽性對照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的吸光度（OD 值）卻明顯偏高，可能原因及應(yīng)對方法詳見下表。

標(biāo)曲不佳，什么原因呢？

ELISA 實驗中標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了倍比稀釋，但標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點 OD 值偏高或偏低，且沒有梯度，可能原因及應(yīng)對方法詳見下表。當(dāng)然，也會存在酶標(biāo)板封閉不足、本底不穩(wěn)定的情況。

標(biāo)曲正常，樣本吸光值極低，什么原因？

ELISA 實驗中標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了倍比稀釋，但標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點 OD 值偏高或偏低，且沒有梯度，可能原因及應(yīng)對方法詳見下表。當(dāng)然，也會存在酶標(biāo)板封閉不足、本底不穩(wěn)定的情況。

此外，如果肉眼觀察酶標(biāo)板顯色正常，而上機所測 OD 異常，可檢測酶標(biāo)儀參數(shù)的設(shè)定以及濾光片是否匹配。洗滌液多為非離子型中性緩沖液，既含有親水集團(tuán)，也含有疏水基團(tuán)，可以使吸附在酶標(biāo)板上的蛋白解離而溶于水中，去除非特異性吸附物質(zhì)，但是濃度太高時，會引起包被抗體脫落。所以需要正確稀釋。同時應(yīng)該用高質(zhì)量的純凈水稀釋，不能引入別的離子，以免對抗原抗體結(jié)合和酶促反應(yīng)產(chǎn)生影響。

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