化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量促使產(chǎn)生能級躍遷，從而發(fā)光，典型的如魯米諾檢測血跡；熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，必須提供光源去激發(fā)分子產(chǎn)生能級躍遷，進而發(fā)光。使用上述兩種方法進行免疫分析時，其區(qū)別很明顯，化學(xué)發(fā)光無需外加光源，背景干擾小；而熒光則需要外加光源，在垂直光源的方向上檢測，生物樣品中的蛋白質(zhì)、氨基酸等分子也會產(chǎn)生背景熒光，背景稍高一些，需要選擇合適的熒光試劑，以及樣品處理方法以減少非特異性吸附蛋白的影響。免疫熒光細胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。  在細胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量 ?！?nbsp; 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。 　　免疫熒光細胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補體法。 　　一、直接法 　　1．檢查抗原法 這是最早的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差　2．檢查抗體法 將抗原標記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體定位檢測出來。 　　二、間接法 　　1．檢查抗體法（夾心法）　　此法是先用特異性抗原與細胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。 　　2．檢查抗體法　　用已知抗原細胞或組織標本的切片，加上待檢血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性igg熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必需用抗人igg熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段  間接法 　　3．檢查抗原法雙薄片　　此法是直接法的重要改進，先用特異性（對細胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細胞標本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱第二抗體，種特異性）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗全顯著多于直接法，從而提高了敏感性。    如細胞抗原上每個分子結(jié)合3～5個分子抗體，當此抗體作為抗原時又可結(jié)合3～5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強3至4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標記顯示。這是現(xiàn)在*泛應(yīng)用的技術(shù)。  三、補體法 　　1．直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法　　用抗補體c3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補體反應(yīng)，而形成抗原抗體補體復(fù)合物---抗補體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。2．間接檢查組織內(nèi)抗原法　　常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原補體抗體反應(yīng)，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原抗體—抗補體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標記顯示。 　　四、雙重免疫熒光標記法 　　在同一細胞組織標本上需要同時檢查兩種抗原時，要進行雙重?zé)晒馊旧?，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗a和抗b）以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗a抗體用異硫氰酸熒光素標記，發(fā)黃綠色熒光；抗b抗體用tmritc或rb200標記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。 　　五、對照試驗 　　為了保證免疫熒光細胞化學(xué)染色的準確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗時進行以上對照試驗： 　　1．直接法　需設(shè)下述對照試驗 　?。?）標本自發(fā)熒光對照：標本只加pbs或不加pbs，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光（無與特異性熒光相似的熒光）。 　?。?）抑制試驗：可分為二步法和一步法。 　?、俣揭种品ǎ簶吮鞠燃游礃擞浀奶禺愋钥贵w，再加標記熒光抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。 　?、谝徊揭种品ǎ合葘晒饪贵w用未標記抗體作適量混合，再加在標本上染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。此法效果較二步法好，并且簡便。 　?。?）陽性對照：用已知陽性標本作直接法免疫熒光染色，結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。 　　如對照（1）和（2）無熒光或弱熒光，（3）和待檢查標本呈強熒光即為特異性陽性熒光。 　　2．間接法 　?。?）自發(fā)熒光對照：同上（一）。 　?。?）熒光抗體對照：標本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。 　　（3）抑制試驗：同上。 　　（4）陽性對照：同上。 　　如對照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽性對照和待檢標本陽性則為特異性熒光。 　　3．補體法 　?。?）自發(fā)熒光對照 　?。?）熒光抗體對照 　　（3）抑制試驗 　?。?）補體對照：取新鮮豚鼠血清1：10稀釋先作用標本，再用抗補體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。 　?。?）抑制試驗：標本加滅活的第一抗體，再用1：10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標記的抗補體血清與抗補體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。 　?。?）陽性對照：（1）～（5）結(jié)果陰性，（6）和待檢標本陽性時，則為特異性熒光。