貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞免疫熒光染色方法步驟（以間接免疫熒光法為例）

1 細(xì)胞準(zhǔn)備與固定

（1）單層生長(zhǎng)細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種到預(yù)先放置幾張6×22mm蓋玻片的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-3天，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層，取出蓋玻片，進(jìn)入PBS（0.01 mol/L,pH7.4）洗2次，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇適當(dāng)固定劑固定細(xì)胞。常用固定劑有：95％乙醇（固定時(shí)間10-30min），丙酮（5－10min）等。

（2) 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm，5min）2次，或用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片，把細(xì)胞片浸入95％乙醇或丙酮中固定。

2 將已經(jīng)固定的細(xì)胞玻片放入蓋片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。

3 滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體，置于濕盒內(nèi)，37度保溫30－60min或度冰箱過(guò)夜

4 PBS振洗3次，每次5min，吹干。

5 滴加適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記抗體，置于濕盒內(nèi)，37度保溫30－60min。

6 PBS振洗2次，每次5min，然后用蒸餾水振洗1次。

7 50％緩沖甘油封片。

【結(jié)果】

在熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性部位出現(xiàn)熒光，依熒光素種類不同呈現(xiàn)不同顏色的熒光，入FITC呈現(xiàn)黃綠色熒光，羅丹明B200呈現(xiàn)橙紅色熒光。

標(biāo)本染色反應(yīng)后應(yīng)及時(shí)觀察并照相。若無(wú)時(shí)間立即觀察標(biāo)本，可把標(biāo)本放入4度冰箱保存。但應(yīng)注意，過(guò)夜后特異性熒光減弱30％，一周后則減弱50％。如果用聚乙-烯醇封片，可保存較長(zhǎng)時(shí)間。