實(shí)驗(yàn)方法原理 :   

RNA 提取過程中應(yīng)注意的是：組織或細(xì)胞在變性液中*裂解的同時(shí)，如何抑 RNase 引起的 RNA 降解問題。在直接加工新鮮組織時(shí)，所有的細(xì)胞能盡可能快的接觸變性劑以*裂解這一步是相當(dāng)重要的。一些難以加工的組織，例如：堅(jiān)硬的腫瘤、細(xì)菌細(xì)胞、植物根部等，即使使用勻漿器一般也不能很有效的裂解。此時(shí)，通常可以在處理組織時(shí)，先對其進(jìn)行冷凍處理，以使之充分裂解。

為使迅速冷凍樣品，以使整塊組織*冷凍，因此，在冷凍前應(yīng)先將組織切成小塊，然后將其浸沒于液氮中。這將會(huì)使組織塊以快的方式冷凍。另外，也可將一個(gè)金屬盤置于干冰上作為冷凍的表面，以對片狀的組織進(jìn)行快速的冷凍。

下面三種力法分別描述用三種不同的方式加工 0.lg 冷凍的小鼠肝臟組織，以產(chǎn)生組織/細(xì)胞裂解產(chǎn)物。裂解產(chǎn)物可進(jìn)行 RNA 的提取純化，或用于估計(jì) pdy(A）+RNA 的產(chǎn)量。雖然這三種方法同是利用胍緩沖液以*裂解細(xì)胞，但是它們在先前的步驟中，即如何加工組織或是在如何裂解的過程中有所不同。

實(shí)驗(yàn)步驟：

方法一: 在勻漿器中加工冷凍的組織

產(chǎn)量：4.1ugpoly(A)ˉRNA

冷凍的組織在干冰上被切成大約 Cl5 cm2 的小片，轉(zhuǎn)人勻漿器中，一邊緩緩加入裂解緩沖液一邊不斷的勻漿。

方法二：通過注射器加工冷凍的組織。

產(chǎn)量：3.2ugpoly(A)-RNA。

冷凍的組織在干冰被切成大約 0.5 cm2 的小片，一邊緩緩加人裂解緩沖液一邊通過 18 號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)注射針頭反復(fù)抽打十次。

方法三：在液氮中將組織研磨成粉末。

產(chǎn)量：7.1ugpoly(A)ˉRNA。

將冷凍的樣品放在研缽中進(jìn)行劇烈研磨以使其粉碎。當(dāng)組織被磨成粉狀后，向研缽中加人變忭緩沖液，并攪拌均勻?；旌衔锶诨髴?yīng)轉(zhuǎn)移到合適的容器中進(jìn)行進(jìn)一步的操作。在液氮中研磨組織至粉末狀，細(xì)胞的裂解則更*，因此能得到比前兩種方法多近一倍的產(chǎn)量。

可見，即使對于 N—種組織，采用同一種試劑進(jìn)行 RNA 的提取，僅僅由于組織樣品處理方法的不同，就導(dǎo)致了 RNA 提取量的顯著差異。因此，在對不同的組織進(jìn)行 RNA 提取時(shí)，不僅要選擇合適的提取方法，同時(shí)也要根據(jù)所處理的組織，以及提取目的以選擇為合適的組織處理方法，只有這樣才能獲得效果。