細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)技術(shù)資料

　　細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)，Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一種以DiI為熒光探針，并提供了染色增強(qiáng)劑、能快速靈敏地對細(xì)胞膜進(jìn)行紅色熒光染色標(biāo)記的試劑盒。

　　DiI即DiIC18(3)，全稱為1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，分子式為C59H97ClN2O4，分子量為933.88，CAS號為41085-99-8，是常用的細(xì)胞膜熒光探針之一，呈現(xiàn)橙紅色熒光。DiI是一種親脂性羰花青(carbocyanine)染料，具有很長的親脂性烴鏈，進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴(kuò)散逐漸使整個細(xì)胞的細(xì)胞膜被染色，染色后非常穩(wěn)定。

　　DiI在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強(qiáng)的熒光。DiI被激發(fā)后可以發(fā)出橙紅色的熒光，DiI和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。其中，最大激發(fā)波長為549nm，最大發(fā)射波長為565nm。

　　DiI和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

　　DiI被廣泛用于正向或逆向的、活的或固定的神經(jīng)等細(xì)胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑(long-term tracer)。DiI毒性很低，通常不會影響細(xì)胞的生存力(viability)。被DiI標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下可以存活長達(dá)4周，在體內(nèi)可以長達(dá)一年。DiI在經(jīng)過固定的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的遷移速率為0.2-0.6mm/day，在活的神經(jīng)元細(xì)胞膜上的遷移速率為6mm/day。

　　本試劑盒提供了染色增強(qiáng)劑，使細(xì)胞膜染色更加快速，熒光染色更加明亮，染色背景更低。

　　本試劑盒除了簡單的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記外，還可以用于檢測細(xì)胞的融合和粘附，檢測發(fā)育或移植過程中細(xì)胞遷移，通過FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測脂在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散，檢測細(xì)胞毒性和標(biāo)記脂蛋白等。

　　本試劑盒可以直接染色活的細(xì)胞或組織，染色時間通常為5-20分鐘。對于固定的細(xì)胞或組織，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?dǎo)致熒光背景較高。本試劑盒對HeLa細(xì)胞的染色效果參考圖2。

　　細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)對HeLa細(xì)胞的染色效果。DiI的染色時間為10分鐘。

　　DiI染色后可以兼容免疫熒光實驗。建議使用免疫染色通透液(Saponin) (P0095)或使用洋地黃皂苷(ST1272)配制的不會溶解細(xì)胞膜的通透液進(jìn)行通透，其它去垢劑配制的通透液可能會溶解細(xì)胞膜上的脂類物質(zhì)，造成DiI失去結(jié)合位置，最終導(dǎo)致DiI的染色失效。但通透也可能會影響DiI在細(xì)胞膜上的定位并會增加細(xì)胞內(nèi)的染色，具體實驗中需根據(jù)實驗的需求選擇合適的細(xì)胞通透液。

　　本試劑盒小包裝C1991S，如果用于流式細(xì)胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5ml時，可以進(jìn)行200次檢測;96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以進(jìn)行1000次檢測。

　　包裝清單：

　　產(chǎn)品編號產(chǎn)品名稱包裝

　　C1991S-1DiI (400X)0.25ml

　　C1991S-2染色增強(qiáng)劑(400X)0.25ml

　　C1991S-3染色緩沖液100ml

　　—說明書1份

　　保存條件：

　　-20℃避光保存，一年有效。染色增強(qiáng)劑(400X)和染色緩沖液也可保存在4℃。

　　注意事項：

　　熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

　　染色緩沖液經(jīng)過過濾除菌處理，在使用時須注意避免微生物污染，否則很可能嚴(yán)重影響染色效果。如果染色緩沖液發(fā)生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續(xù)使用。

　　如果染色時間過長或染色后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，探針也可能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而染色其它細(xì)胞器的膜。

　　本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

　　為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

　　使用說明：

　　1.溶液制備：

　　a.細(xì)胞膜染色工作液的用量：對于6、12、24、96孔板，每孔的細(xì)胞膜染色工作液分別為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl;對于流式細(xì)胞樣品，每個樣品的細(xì)胞膜染色工作液為0.5ml;對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的細(xì)胞膜染色工作液。

　　b.細(xì)胞膜染色工作液的配制：根據(jù)樣品數(shù)量和每個樣品所需工作液的體積，計算出細(xì)胞膜染色工作液的總體積。以流式細(xì)胞儀檢測為例，每個樣品的細(xì)胞膜染色工作液為0.5ml，參照下表配制細(xì)胞膜染色工作液。

　　注意：請嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制細(xì)胞膜染色工作液，且DiI (400X)和染色增強(qiáng)劑(400X)混勻后再加入染色緩沖液。對于活細(xì)胞染色的情況，如果細(xì)胞對于培養(yǎng)條件非常敏感，也可以使用正常的細(xì)胞培養(yǎng)液代替本試劑盒提供的染色緩沖液用于配制細(xì)胞膜染色工作液。使用正常的細(xì)胞培養(yǎng)液替代染色緩沖液的情況，可能會導(dǎo)致染色效果有所下降，此時需要適當(dāng)考慮延長染色時間或加大DiI染料濃度。

　　樣品數(shù)220200

　　DiI (400X)2.5μl25μl250μl

　　染色增強(qiáng)劑(400X)2.5μl25μl250μl

　　染色緩沖液995μl9.95ml99.5ml

　　細(xì)胞膜染色工作液總體積1ml10ml100ml

　　注：不同細(xì)胞的最佳染色濃度略有不同，細(xì)胞膜染色工作液的最終濃度建議根據(jù)不同細(xì)胞系和實驗體系進(jìn)行優(yōu)化，可在1:100-1:400之間進(jìn)行調(diào)整。DiI的最終濃度提高時，染色增強(qiáng)劑的用量不變。

　　2.懸浮活細(xì)胞染色：

　　a.加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液重懸細(xì)胞，使其密度為1-2×106/ml左右。

　　b.37℃避光孵育細(xì)胞5-20min，不同的細(xì)胞最佳孵育時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據(jù)實際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。

　　c.500-1000×g室溫離心5min。

　　d.吸除上清液，再次緩慢加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

　　e.重復(fù)c、d步驟兩次。

　　f.流式細(xì)胞儀檢測，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)移至多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿或者細(xì)胞爬片上，在熒光顯微鏡下觀察。DiI的最大激發(fā)光波長為549nm，最大發(fā)射光波長為565nm。

　　3.貼壁活細(xì)胞染色：

　　a.將貼壁細(xì)胞種于細(xì)胞培養(yǎng)皿、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者細(xì)胞爬片上。

　　b.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用Hanks' Balanced Salt Solution (C0218或C0219)或PBS (C0221A、C0221D或C0221G)洗滌細(xì)胞2遍。

　　c.加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。

　　d.37℃避光孵育細(xì)胞5-20min，不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據(jù)實際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。

　　e.吸除細(xì)胞膜染色工作液，用Hanks' Balanced Salt Solution或PBS洗滌2-3次，然后加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液即可在熒光顯微鏡下觀察。DiI的最大激發(fā)光波長為549nm，最大發(fā)射光波長為565nm。

　　4.染色后的固定和通透：

　　a.固定：如果樣品需要進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光實驗，建議使用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定液(P0099)進(jìn)行固定。

　　b.通透：建議使用0.1% Triton X-100 (ST795)或洋地黃皂苷(ST1272)進(jìn)行通透。但通透可能會影響DiI在細(xì)胞膜的定位并會增加細(xì)胞內(nèi)的染色，具體實驗中需根據(jù)實驗的需求選擇合適的細(xì)胞通透液。

　　注：如果需要封片，建議直接用PBS進(jìn)行封片。請避免使用含有甘油或其它有機(jī)物的封片劑，否則會影響染色并增加熒光背景。

　　5.固定后細(xì)胞或切片的染色：

　　a.使用4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)進(jìn)行固定。

　　b.吸除固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3遍。

　　c.選做：使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100 (ST795)進(jìn)行通透，室溫10min。然后用PBS洗滌細(xì)胞3遍。

　　d.選做：按照免疫染色的方法進(jìn)行抗體的孵育或用其它染料進(jìn)行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能含有去垢劑。

　　e.加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞或樣品。

　　f.37℃避光孵育5-20min，最佳染色時間需要根據(jù)自己的實驗條件摸索，以達(dá)到最佳的熒光染色效果。

　　g.吸除細(xì)胞膜染色工作液，用PBS洗滌2-3次，隨后即可在熒光顯微鏡下觀察。DiI的最大激發(fā)光波長為549nm，最大發(fā)射光波長為565nm。

　　細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒