多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒(組合系列)

　　組織微環(huán)境中有復(fù)雜的細(xì)胞組成，這些細(xì)胞的表型、狀態(tài)、豐度、分布都有著重要的生物學(xué)意義和臨床價(jià)值。借助抗體染色可以將其在組織原位上呈現(xiàn)出來(lái)。免疫組化染色是一種研究組織形態(tài)和原位蛋白表達(dá)的常見(jiàn)技術(shù)，常規(guī)IHC檢測(cè)只能展示單一指標(biāo)，難以呈現(xiàn)復(fù)雜的組織微環(huán)境中的細(xì)胞組成、狀態(tài)和關(guān)系，而這些信息對(duì)疾病的診斷和治療至關(guān)重要!

　　酪氨信號(hào)放大技術(shù)原理：類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術(shù)同樣采用HRP標(biāo)記的二抗，HRP催化加入體系的熒光素底物，生產(chǎn)活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨s共價(jià)結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價(jià)結(jié)合的抗體，在換下一種一抗來(lái)第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。

　　應(yīng)用主要用于人源或小鼠組織、石蠟切片、TMA芯片的免疫組化染色。

　　使用方法樣本要求：

　　1. 福爾馬林固定的蠟塊或玻片，大塊組織或TMA，封蠟不能有明顯的破損。

　　2. 玻片樣本，組織需要緊貼玻片，避免褶皺，玻片不能有破損、劃傷或污漬。

　　3. 組織最小應(yīng)包含大于1000 個(gè)細(xì)胞。

　　4. 蠟塊需包埋實(shí)體瘤組織，壞死瘤組織、細(xì)針穿刺物、細(xì)胞甩片樣品會(huì)影響染色效果。

　　5. 組織應(yīng)當(dāng)用10%中性福爾馬林固定，正常固定時(shí)間為18～24 小時(shí)。

　　6. 切片厚度為4um 左右，使用防脫玻片。建議玻片在固定后一周內(nèi)制備為佳。

　　7. 不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑，樣本應(yīng)置于玻片正面、中央。將撈片豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴。

　　8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，確保水分去除、貼片牢固。

　　試劑準(zhǔn)備：

　　1) TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)

　　2) 抗原修復(fù)液：根據(jù)一抗選擇檸檬酸鈉或者EDTA修復(fù)液

　　3) 抗體稀釋液：可做抗體稀釋和封閉使用，即用型

　　4) 一抗工作液：現(xiàn)用現(xiàn)配，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化濃度

　　5) 二抗工作液：二抗工作液為HRP-羊抗鼠兔或兔雙抗

　　6) 熒光染料染色工作液：系列單色熒光染料為200X 母液，使用前用TSA 信號(hào)放大反應(yīng)液1:

　　200 稀釋用配好的工作液4℃保存，僅限當(dāng)天使用。

　　7) DAPI 工作液：DAPI 使用無(wú)菌水按1：100稀釋制備工作液

　　操作步驟：建議采用實(shí)驗(yàn)操作表格進(jìn)行記錄

　　1. 樣品脫蠟準(zhǔn)備：

　　a) 溫箱設(shè)置到55℃-60℃，烤片1h 以上。

　　b) 新鮮二甲苯浸片10min，重復(fù)3 次。

　　c) 梯度乙醇浸片：100% 3min;95% 3min;70% 3min。

　　d) 滅菌水洗片1min，重復(fù)3 次。

　　2. 多重?zé)晒饷庖呓M化染色步驟(A、B、C 三種抗體為例) ：

　　A 抗體

　　A.1 抗原修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min 煮沸，立刻放入切片，低火(約20%功率) 繼續(xù)加熱15min 后冷卻至室溫。進(jìn)行該步驟之前建議不放樣品進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)15min 后液面是否高于樣品，避免干片，抗原修復(fù)液不能2 次使用。

　　A.2 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。

　　A.3 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋A 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　A.4 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標(biāo)記二抗抗體，浸沒(méi)樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　A.5 熒光染色放大信號(hào)：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　A.6 微波修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火(約20%功率)繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。

　　B 抗體

　　B.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。

　　B.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋B 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　B.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標(biāo)記二抗抗體，浸沒(méi)樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　B.4 熒光染色放大信號(hào)：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　B.5 微波修復(fù)：把1X 抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火(約20%功率) 繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。

　　C 抗體

　　C.1 封閉：去除玻片上殘存洗液，用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加抗體稀釋液/封閉液，覆蓋樣本區(qū)域， 室溫孵育10min。

　　C.2 一抗孵育：用抗體稀釋液按照推薦比例稀釋C 抗體，去除玻片上的封閉液，加一抗至覆蓋樣本，室溫孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　C.3 二抗孵育：去除玻片上殘存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 標(biāo)記二抗抗體，浸沒(méi)樣本區(qū)域，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　C.4 熒光染色放大信號(hào)：去除玻片上殘存的洗液，滴加熒光染料染色工作液，室溫孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分鐘。

　　C.5 微波修復(fù)：把1X 堿性抗原修復(fù)液倒入修復(fù)杯中微波爐高火加熱3min，立刻放入切片，低火(約20%功率) 繼續(xù)加熱10min 后冷卻至室溫。

　　每輪染色結(jié)束后可用熒光顯微鏡確認(rèn)染色情況，注意用TBST 覆蓋樣品，防止干片。

　　3. DAPI 復(fù)染及封片：

　　去除玻片上殘存洗液，滴加DAPI 工作液，室溫孵育5min，用1X TBST 浸洗玻片2 分鐘，用滅菌水洗片2 分鐘， 在樣品上滴加適量抗淬滅封片劑，加蓋玻片，小心排除氣泡，用透明指甲油封住蓋玻片四周，室溫晾干，4℃ 避光保存。

　　4. 成像：

　　選用成像設(shè)備按照染料光譜條件設(shè)置拍攝條件，對(duì)染色后的組織片在熒光顯微鏡下數(shù)據(jù)并進(jìn)行

　　判讀分析。

　　多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒