Elisa實(shí)驗(yàn)| ELISA試劑盒的應(yīng)用和類型

　　一、ELISA是什么?

　　ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的簡(jiǎn)稱。它是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù) 。

　　ELISA是一種廣泛應(yīng)用在測(cè)定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序，通常是把蛋白、抗體、或激素等(即抗原)直接或是以捕捉抗體(capture Ab)固定在固相載體上，再加入一級(jí)檢測(cè)抗體(primarydetection Ab)，形成一個(gè)抗原抗體的復(fù)合物。如果該抗體已經(jīng)用酶(enzyme)標(biāo)記了，即可用來(lái)直接測(cè)定抗原的量，若無(wú)，則可利用另一個(gè)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原的量。測(cè)定抗原量的方法是加入該酶的底質(zhì)(substrate)，作用后產(chǎn)生出現(xiàn)的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系，依此原理計(jì)算出樣本中的抗原總量或濃度

　　二、ELISA通常分為四種類型：直接法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法等

　　1.直接法(Direct ELISA)僅需要抗原和酶標(biāo)一抗，操作簡(jiǎn)便，可避免交叉反應(yīng)，然而該方法要求酶標(biāo)一抗有較高的特異性要求，同時(shí)也并非所有的一抗適合標(biāo)記處理。直接法在實(shí)際運(yùn)用中并不多見，它并不能對(duì)樣本中抗體進(jìn)行定量分析，因?yàn)闃颖局锌贵w是非酶標(biāo)抗體，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)顯色。該法經(jīng)過改進(jìn)就是競(jìng)爭(zhēng)法。

　　2.間接法(Indirect ELISA)使用了二抗增加信號(hào)強(qiáng)度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。間接法只能用于測(cè)定抗體，主要用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)是只需要改變包被抗原，酶標(biāo)抗體是通用的。

　　3.夾心法(Sandwich ELISA)分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

　?、匐p抗體夾心法中抗原被兩個(gè)抗體——捕捉抗體和檢測(cè)抗體，結(jié)合于不同位點(diǎn)。捕捉抗體固定于載體上，檢測(cè)抗體通過結(jié)合抗原進(jìn)行顯色分析。應(yīng)用于雙抗體夾心法檢測(cè)的抗體需是單抗，而且對(duì)同一抗原結(jié)合位點(diǎn)不同，如此才能避免交叉反應(yīng)或兩種抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同一位點(diǎn)。夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢(shì)，但該法只適用于有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗原檢測(cè)，主要用于檢測(cè)各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中測(cè)定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測(cè)過程中有時(shí)會(huì)將樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)(一步法)，此時(shí)如果樣本中抗原含量過高會(huì)導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而 不形成“夾心復(fù)合物"，此時(shí)測(cè)出的結(jié)果將低于實(shí)際含量甚至是陰性結(jié)果(鉤狀效應(yīng)hook ffect)。因此，如果使用一步法測(cè)定樣本中抗原含量時(shí)要注意測(cè)量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。

　?、陔p抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測(cè)樣本中的抗體結(jié)合于抗原后，使用酶標(biāo)的抗原進(jìn)行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng)，可以用來(lái)測(cè)定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上測(cè)定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測(cè)時(shí)被測(cè)樣本不需要稀釋即可直接進(jìn)行測(cè)定，故此靈敏度相對(duì)而言高于間接法。

　　4.競(jìng)爭(zhēng)法(Competitive ELISA)是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體(或抗原)濃度越高，則能與固定抗原(或抗體)結(jié)合的酶標(biāo)抗體(或抗原)就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對(duì)照相比，顯色越淺，表示檢測(cè)樣本中抗體(或抗原)含量越高。該法適合比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測(cè)的靈敏度和專一性較差。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體常常用于檢測(cè)某些干擾物質(zhì)不易去除的樣本及難以純化得到抗原等情況。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原常用于檢測(cè)小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個(gè)以上的識(shí)別位點(diǎn)，不適用于雙抗夾心法進(jìn)行測(cè)定。

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