ELISA實(shí)驗(yàn)“溫育"操作是不是只能在37℃條件下完成

　　溫育是ELISA試劑盒測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA實(shí)驗(yàn)作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育(incubation)，也被稱之為孵育。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。

　　溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，ELISA試劑盒有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中放置一晚上，以形成zui多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用。

　　ELISA試劑盒操作步驟(通用)：

　　1. 加標(biāo)準(zhǔn)品：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，ELISA試劑盒 依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50ul(建議每個(gè)濃度做2個(gè)平行孔)人ELISA試劑盒。

　　2. 加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。大鼠ELISA試劑盒在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品40μl，然后再加樣品親和素10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻小鼠ELISA試劑盒。

　　3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘ELISA試劑盒。

　　4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，大鼠ELISA試劑盒每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干小鼠ELISA試劑盒。

　　6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外ELISA試劑盒。

　　7. 溫育：操作同3。

　　8. 洗滌：操作同5。

　　9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘人ELISA試劑盒.

　　10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn))。

　　測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

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