ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫法基本原理及注意事項(xiàng)

　　ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫法留神事項(xiàng)：

　?、?正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)別離以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照操控試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證試驗(yàn)效果的性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　⒉ 在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)條件的挑選是很首要的，其間包含：

　?、?固相載體的挑選：很多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其辦法可所以凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)時(shí)常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在運(yùn)用前均可進(jìn)行挑選：用等量抗原包被，在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行反響，查詢其顯色反響是不是均一性，據(jù)此判明其吸附功能是不是超卓。

　?、?包被抗體(或抗原)的挑選：將抗體(或抗原)吸附在固相載體外表時(shí)，央求純度要好，吸附時(shí)一般央求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)刻及其蛋白量也有必定影響，一般多選用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不一樣的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相一同，查詢陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。挑選OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于大都蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)一般為1～10μg/ml。

　?、?ELISA試劑盒酶符號(hào)抗體作業(yè)濃度的挑選：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶符號(hào)抗體部份)。然后再固定其它條件或選用“方陣法"(包被物、待檢樣品的參看品及酶符號(hào)抗體別離為不一樣的稀釋度)在正式試驗(yàn)系統(tǒng)里地滴定其作業(yè)濃度。

　?、?酶的底物及供氫體的挑選：對(duì)供氫體的挑選央求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌效果，應(yīng)留神防護(hù)。有條件者應(yīng)運(yùn)用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是當(dāng)時(shí)較為滿意的供氫體。底物效果一段時(shí)刻后，應(yīng)參加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以間斷反響。一般底物效果時(shí)刻，以10-30分鐘為宜。底物運(yùn)用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前參加。

　　①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并堅(jiān)持其免疫活性。

　?、谑箍乖蚩贵w與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)守時(shí)，把受檢標(biāo)本(測(cè)定其間的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不一樣的進(jìn)程與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗刷的辦法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分隔，終究結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成必定的份額。參加酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩唐罚唐返牧颗c標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接有關(guān)，故可根據(jù)色彩反響的深淺來(lái)進(jìn)行定性或定量分析。因?yàn)槊傅拇呋l率很高，故可極大地拓展反響效果，從而使測(cè)定辦法抵達(dá)很高的敏感度。

　　ELISA試劑盒可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定辦法中有3種必要的試劑：

　?、俟滔嗟目乖蚩贵w

　?、诿阜?hào)的抗原或抗體

　?、勖感Ч牡孜?。根據(jù)試劑的來(lái)歷和標(biāo)本的性狀以及檢查的具備條件，可規(guī)劃出各種不一樣類(lèi)型的檢查辦法。

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