Elisa實(shí)驗(yàn)：ELISA數(shù)據(jù)結(jié)果如何來判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)指將抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合的專一性，并結(jié)合酶對底物的高效催化作用， 通過底物的顯色反應(yīng)及顏色深淺，進(jìn)行定性或定量的一種檢測方法。

　　ELISA為固相非均相反應(yīng)，依檢測原理，主要分為三種：夾心ELISA法、競爭ELISA法、間接ELISA法;夾心法又可分為雙抗體夾心法、雙抗原夾心法;競爭法有直接競爭法、間接競爭法?；谀康牡牟煌挚煞譃槎縀LISA和定性ELISA。

　　ELISA作為起源于19世紀(jì)的一項(xiàng)成熟檢測技術(shù)，因其具有的優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用廣泛。

　　概括而言，其檢測主要操作步驟有加樣、溫育、洗板、顯色、判讀;相應(yīng)的所需儀器則較普遍常用，如酶標(biāo)儀(多功能酶標(biāo)儀)、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、自動(dòng)洗板機(jī)、微孔振蕩器;其他如排槍、量筒等實(shí)驗(yàn)室更為常用。

　　而對于實(shí)驗(yàn)者來說，準(zhǔn)確、、可重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是最佳的，若要取得理想的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需從影響ELISA檢測結(jié)果的因素著手，多加注意 。

　　縱觀全局，影響因素不外乎以下幾個(gè)方面：

　　1、樣品方面

　　ELISA作為一項(xiàng)成熟的檢測技術(shù)，適用于多種樣本的檢測。其中血清、血漿、尿液、唾液等樣本較為常見，規(guī)范的取樣操作、合適的存放條件都是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的必要條件。

　　實(shí)際上，樣本采集、存放過程中很多因素可能引起檢測結(jié)果的差異，如溶血樣本由于紅細(xì)胞裂解釋放出具有過氧化酶活性的物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)生非特異性顯色反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性 。

　　部分資料顯示，對于溶血樣本，可以測定血清Hb濃度判斷溶血程度。非溶血標(biāo)本血清游離Hb為4.8±3.2mg/dL，中度溶血血清Hb為43.5±13.9mg/dL。超過此范圍的樣本最好做復(fù)檢，避免假陽性結(jié)果

　　依據(jù)檢測指標(biāo)，選擇合適的樣本，而對于較為敏感指標(biāo)(如LDH、ACP等)，即使輕微溶血也可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏高，此類樣本應(yīng)盡量避免使用。

　　對于溶血判斷，較為簡易便捷的方法則是肉眼觀察，當(dāng)血清清亮，呈櫻紅色，為中度溶血，此時(shí)需重新采集。為更好避免溶血情況發(fā)生，建議SST管或抗凝管采樣。

　　高脂血同樣也是比較常見的，嚴(yán)重的也稱為牛奶血，呈乳白色或混濁狀，其通過不均一性、脂質(zhì)顆粒粘附在管壁等影響檢測結(jié)果。理論采用高速離心可除去，但可能對檢測結(jié)果有影響。另外，樣本污染或存放不當(dāng)都會對檢測結(jié)果造成影響，如樣本受到細(xì)菌污染，則會產(chǎn)生非特異性顯色而干擾結(jié)果;塑料管能吸附抗原使樣本內(nèi)抗原含量下降，容易假陰性，最好使用真空采血管。

　　2、操作方面

　　ELISA是一項(xiàng)可重復(fù)性很高的檢測技術(shù)，操作簡便易行，但操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對實(shí)驗(yàn)的檢測效果影響較大，正確嚴(yán)格的操作是保證實(shí)驗(yàn)成果的關(guān)鍵。

　　對于加樣：ELISA是基于微孔板的反應(yīng)，所需樣本量較小，若樣本粘附于孔壁或加樣量不足，微孔板內(nèi)樣本量不足以參與與抗原或抗體的反應(yīng)，則會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

　　因此充足的樣本量是首要條件，考慮使用準(zhǔn)確性高的移液器且定期進(jìn)行校正，加樣時(shí)宜垂直懸空加入微孔底部，需注意避免碰到管底或管壁，防止濺出或產(chǎn)生氣泡，同時(shí)更換槍頭，做到“一樣一吸頭"，避免交叉污染。對于溫育：ELISA是基于抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)需要合適的溫度。對于大多數(shù)抗原抗體，37℃是最佳反應(yīng)溫度，結(jié)合效率高。

　　ELISA操作中需將酶標(biāo)板置于合適的溫度溫育，由于酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別，較易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，同時(shí)基于很多恒溫箱構(gòu)造，溫度顯示并非酶標(biāo)板溫育溫度，導(dǎo)致個(gè)別樣本檢測結(jié)果異常?？蛇x用水浴法溫育，避免受熱不均產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，同時(shí)貼上密封膜防止污染或液體蒸發(fā)，切勿縮短溫育時(shí)間。對于洗板：其目的在于除去非特異性成分，使免疫復(fù)合物與待測抗體 (抗原) 呈一定比例，洗板是ELISA操作中重要的環(huán)節(jié)。

　　有條件的實(shí)驗(yàn)室，可采用機(jī)洗，可在一定程度避免污染，提高效率，需注意觀察洗液針、沖洗頭是否通暢 ，這是考慮到血清中殘留纖維蛋白絲或洗滌液有析出的結(jié)晶存在時(shí)，易使洗板機(jī)針孔阻塞;調(diào)整注水量，設(shè)置好洗板時(shí)間及次數(shù)、力度，避免力度過大造成酶結(jié)合物丟失，檢測結(jié)果偏低。

　　對于不方便的實(shí)驗(yàn)室，則可用手洗，可反復(fù)模擬操作，避免洗板不干凈造成“花板"，影響檢測結(jié)果。洗板結(jié)束后將板垂直扣于干凈的吸水紙或毛巾上，拍干。對于顯色及判讀：ELISA多用HRP為催化酶，作用于TMB發(fā)生顯色。顯色是最后一步溫育反應(yīng)，研究表明，顯色溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯影響，溫度過低導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速率變慢，顯色不充分，容易漏檢低值結(jié)果。

　　而顯色時(shí)間不宜過短，鑒于一些低滴度可能不能及時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)，造成假陰性結(jié)果。嚴(yán)格控制顯色反應(yīng)的溫度和時(shí)間至關(guān)重要。

　　ELISA測定需要通過酶標(biāo)儀測定，研究資料建議選雙波長，可以減少測定干擾和電路干擾 ，提高臨界值處的樣本的分析正確度，減少對弱陽性樣本的漏檢，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差。

　　3、試劑方面

　　市場ELISA產(chǎn)品眾多，眼花繚亂，參差不齊，高質(zhì)量的產(chǎn)品仍然是重中之重 ，也是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠的先決條件。選擇度相對高的試劑。切忌不要混用，更不要使用過期試劑。實(shí)驗(yàn)操作前，通常需將試劑從冰箱拿出，平衡30-60min，使微孔內(nèi)溫度較快達(dá)到所需溫度，而忽略這一操作可能導(dǎo)致一些弱陽性的樣本出現(xiàn)假陰性。

　　綜上所述，影響ELISA結(jié)果的因素有很多，無論是樣品、操作還是試劑都可能影響到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在進(jìn)行ELISA檢測時(shí)，要采取相應(yīng)措施排除干擾因素，同時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行SOP標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程，認(rèn)真做好ELISA全程質(zhì)量控制，保證ELISA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。

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