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時(shí)間：2023-8-25閱讀：336

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　　原理介紹:酪酰胺信號(hào)放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過(guò)氧化酶(HRP)對(duì)靶蛋白進(jìn)行標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術(shù)同樣采用HRP標(biāo)記的二抗，同樣有對(duì)應(yīng)的“顯色"步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價(jià)結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價(jià)結(jié)合的一抗-二抗-HRP復(fù)合物，重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來(lái)第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復(fù)就可實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。

　　TSA詳細(xì)原理是利用酪胺Tyramide的過(guò)氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、組氨s和酪氨s殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測(cè)信號(hào)得到10-100倍增強(qiáng)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來(lái)催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過(guò)氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨s殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理，前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個(gè)一抗來(lái)第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，后去檢測(cè)結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無(wú)需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問(wèn)題，大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說(shuō)，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標(biāo)都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而且信號(hào)放大的倍數(shù)大大增強(qiáng)。

　　本公司開(kāi)發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為一下其中一種或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或配合使用?？梢詫?shí)現(xiàn)單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)以及多重?zé)晒夥糯?多重同源抗體熒光標(biāo)記等功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

　　試劑盒組成：TYR-520熒光染料(綠光)(即用型，5mL),-20℃;TYR-570熒光染料(紅光)(即用型，5mL)，-20℃;TYR-620熒光染料(即用型，5mL)，-20℃;TYR-690熒光染料(即用型，5mL)，-20℃;TSA+增強(qiáng)劑，100ul，-20℃(可選);高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(10mL)4℃。

　　備注：TYR-520熒光染料、TYR-570熒光染料、TYR-620熒光染料、TYR-690熒光染料在-20度下，均為固體，使用之前需解凍。

　　TSA+增強(qiáng)劑使用方法：TSA+增強(qiáng)劑能夠進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)放大液的放大信號(hào)5-10倍，TSA+增強(qiáng)劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強(qiáng)劑不是必須的選項(xiàng)，可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

　　五色多重免疫熒光試劑盒操作流程：

　　1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二j苯Ⅰ15min-二j苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ。取出放在通風(fēng)廚內(nèi)，酒精晾干后放入自來(lái)水中稍洗，蒸餾水洗。

　　2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法)。中火8min，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來(lái)確定)。

　　3、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%過(guò)氧化氫r液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

　　4、BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

　　5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

　　6、加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。

　　7、熒光染料反應(yīng)：TYRXXX熒光染料反應(yīng)10-15min，PBS洗三次。

　　8、重復(fù)2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

　　9、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

　　10、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

　　11、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

　　染料激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)

　　DAPI藍(lán)色350 420

　　TYR-480 450 480

　　TYR-520綠色490 520

　　TYR-570紅色550 570

　　TYR-620 590 620

　　TYR-690 630 690

　　TYR-780 750 780文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A,B，C and D was performed using a Five-color Fluorescence kit(GuduoBio Biological Technology,Shanghai,China)based on the tyramide signal amplification(TSA)technology according to the manufacture’s instruction.

　　多重?zé)晒馊旧噭┖小迳炃衅噭┖猩虾９哦渖锟萍加邢薰境闪⒂谏虾Ｆ謻|新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。

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