γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γGT)測定(比色法)測試盒說明

　　注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

　　測定意義：

　　γ-GT是γ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨?；衔锷系摩?谷氨酰基轉(zhuǎn)移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨?；衔锏乃猓a(chǎn)生谷a酸鹽，在細胞外谷胱g肽新陳代謝中起了重要的作用。

　　測定原理：

　　γ-GT催化谷氨酰對硝基苯胺中γ-谷氨?；D(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘a酸，生成對硝基苯胺，在405nm有特征光吸收;通過測定405nm光吸收增加速率，來計算γ-GT酶活性。

　　自備儀器和用品：

　　低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水

　　試劑組成和配制：

　　試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

　　試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。

　　試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保存。

　　試劑四：液體14.8mL×1瓶，4℃保存。

　　工作液(在試劑二瓶中配制)：臨用前配制，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解(室溫過低時可以40℃水浴促進溶解);然后把試劑四倒入試劑二瓶中，混勻后室溫保存。

　　粗酶液提?。?/p>

　　組織：按照組織質(zhì)量(g)：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例(建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

　　細菌、真菌：按照細胞數(shù)量(104個)：試劑一體積(mL)為500~1000：1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一)，冰浴超聲波破碎細胞(功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min);然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。

　　3. 血清等液體：直接測定。

　　γ-GT測定操作:

　　1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調(diào)節(jié)波長到405 nm，蒸餾水調(diào)零。

　　2. 試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中預熱30min(保證無沉淀)。

　　3. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，180μL工作液，混勻后于405nm測定10s和70s時吸光度，記為A1和A2。

　　γ-GT活性計算：

　　標準曲線：y=0.006x+0.0016，x為對硝基苯胺濃度，y為吸光值，R2=0.999。

　　a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

　　(1). 按蛋白濃度計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷(Cpr×V樣)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr

　　(2). 按樣本質(zhì)量計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/g 鮮重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W

　　(3)按細胞數(shù)量計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷細胞數(shù)量

　　(4)按液體體積計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T= 1.67 × [ (A2-A1)-0.0016]

　　V反總：反應體系總體積(L)，200μL=2×10-4L;Cpr：蛋白濃度(mg/mL);W ：樣品質(zhì)量;V樣：反應體系中加入上清液體積(mL)，20μL=0.02 mL;V樣總：提取液體積，1 mL;T：反應時間(min)，1min。

　　b.使用96孔板測定的計算公式如下

　　標準曲線：y=0.003x+0.0016，x為對硝基苯胺濃度，y為吸光值，R2=0.999。

　　(1). 按蛋白濃度計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷(Cpr×V樣)÷T=3.34× [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr

　　(2). 按樣本質(zhì)量計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/g 鮮重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W

　　(3)按細胞數(shù)量計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷細胞數(shù)量

　　(4)按液體體積計算

　　活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

　　γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反總÷V樣÷T= 3.34 × [ (A2-A1)-0.0016]

　　V反總：反應體系總體積(L)，200μL=2×10-4L;Cpr：蛋白濃度(mg/mL);W ：樣品質(zhì)量，g;V樣：反應體系中加入上清液體積(mL)，20μL=0.02 mL;V樣總：提取液體積，1 mL;T：反應時間(min)，1min。

　　注意事項：

　　培養(yǎng)細胞中γ-GT活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中γ-GT的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞(防止因為蛋白質(zhì)變性導致酶失活)。

　　配置好的工作液2周內(nèi)使用完畢。

　　γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務質(zhì)量"的方針。