實(shí)驗(yàn)分享：骨組織切片實(shí)驗(yàn)前制備及相關(guān)染色

　　骨組織切片重要的前處理——脫鈣

　　在病理科的日常工作中就出會(huì)收到帶有骨頭的病理組織標(biāo)本，這種標(biāo)本由于含有大量的磷酸鈣和碳酸鈣，一般非常的硬，如果不能做好前期處理，對(duì)我們的HE制片會(huì)造成不小的影響，如切片破損、刀痕嚴(yán)重等問(wèn)題，那么怎樣處理帶有骨頭的病理組織標(biāo)本呢?這個(gè)時(shí)候就需要進(jìn)行我們病理學(xué)中很常見(jiàn)的步驟了，就是組織脫鈣，對(duì)于骨組織來(lái)說(shuō)，脫鈣是關(guān)鍵的步驟，能不能制出好的切片以及后期染色如何。

　　脫鈣前的固定

　　通常情況下，組織中如果含有骨、軟骨等在HE制片錢(qián)都是要經(jīng)過(guò)脫鈣才處理的。首先，骨組織固定時(shí)間要適當(dāng)，至少要達(dá)到24h，但不得不超過(guò)48h。固定時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都不行，固定時(shí)間太久會(huì)嚴(yán)重影響抗原，后續(xù)做免疫組化試驗(yàn)很可能出現(xiàn)假陰性。固定時(shí)間 太短切片會(huì)泛紅，看起來(lái)很奇怪。由于很多實(shí)驗(yàn)室并非恒溫實(shí)驗(yàn)室，但是固定時(shí)間又很長(zhǎng)，因此建議放入4℃冰箱中固定，保持低溫而穩(wěn)定的環(huán)境，效果會(huì)比較好。

　　脫鈣試劑的選擇

　　1)常用的脫鈣液有無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸、混合酸以及電解脫鈣液等。10%-50%的甲酸水溶液是常用的有機(jī)酸。脫鈣時(shí)間由甲酸的濃度而定，10%甲酸脫鈣需要3天，而50%甲酸脫鈣需2天。甲酸濃度越高，脫鈣速度越快，但同時(shí)也會(huì)傷害骨組織，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)不完整，研究鼻腔這種精細(xì)結(jié)構(gòu)時(shí)50%甲酸是不可取的。脫鈣過(guò)程需勤換脫鈣液，保持濃度，推薦在4℃冰箱中溫和地脫鈣。注意，千萬(wàn)不要過(guò)度脫鈣，否則組織會(huì)被酸分解，到時(shí)整個(gè)組織就爛了。

　　2)另外一種有機(jī)酸是EDTA，即乙二胺四乙酸這是一種接近中性液體，可以螯合骨組織中的鈣離子。理論上講它是的科研用脫鈣液，可以地保存骨組織的抗原性、酶類(lèi)等，但它的脫鈣至少需要2周，長(zhǎng)的能到3個(gè)月。

　　3)無(wú)機(jī)酸一般為硝酸。脫鈣強(qiáng)度太大，稍不注意組織就脫爛了，不易控制，一般不推薦使用。室溫下，濃度在8%以上的硝酸脫鈣，超過(guò)2天，組織會(huì)有明顯缺損。

　　4)混合酸即有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸混合使用，但是脫鈣效果不佳，用的較少。

　　脫鈣后的漂洗

　　需要注意的是，不管是用無(wú)機(jī)酸還是有機(jī)酸又或者是混合酸，脫鈣后都需要使用流水充分漂洗。這一步也非常重要。 如果是鼻腔這種精細(xì)的組織，則漂洗6h即可，以免組織吸水后膨脹導(dǎo)致原始位置偏移。 這是好的方法?？梢韵慈ス墙M織中殘留的酸，從而保證骨組織PH為中性，這是保證后期染色正常的重要步驟。如果沒(méi)有漂洗干凈，后期染色會(huì)偏紅，藍(lán)色的細(xì)胞核也會(huì)模糊不清。

　　脫鈣效果的判斷

　　脫鈣時(shí)間的掌握是制片成功的關(guān)鍵，脫鈣時(shí)間太短，會(huì)造成切片時(shí)刀痕嚴(yán)重、切片破碎，脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，又會(huì)造成HE染色不佳、免疫組化染色也容易出現(xiàn)假陰性。那么我們?cè)撊绾闻袛嗝撯}效果呢?經(jīng)濟(jì)、省事的方法就是使用針灸用的針，如果能輕松戳進(jìn)骨組織，則代表脫鈣。如果針身彎曲了還是扎不進(jìn)去，那就更換新鮮的脫鈣液，繼續(xù)脫鈣。

　　骨組織常做的染色

　　1.HE染色

　　HE染色是組織學(xué)中基礎(chǔ)、使用廣泛的染色手段，相信大家對(duì)此都不陌生。HE染色可以區(qū)分一般的骨組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞，但單一的HE染色并不能區(qū)分新生骨組織的數(shù)量、膠原以及其他細(xì)胞狀態(tài)，大多數(shù)都需要配合其他染色技術(shù)共同觀察骨愈合狀態(tài)。特別的，現(xiàn)在都需要對(duì)新生組織進(jìn)行量化研究，HE染色顯然是不能滿足要求的。

　　2.Masson染色

　　Masson染色的顏色對(duì)比鮮明，可見(jiàn)明顯的膠原纖維網(wǎng)(苯胺藍(lán)染色則為藍(lán)色，甲基綠則為綠色)，能較好地反映纖維組織的形態(tài)。其中，藍(lán)色表示新形成的骨，紅色表示成熟的骨組織。

　　3.番紅O-固綠染色

　　番紅O-固綠染色可直觀反映關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下的骨組織結(jié)構(gòu)，嗜堿性的軟骨與堿性染料番紅 O 結(jié)合呈現(xiàn)紅色，嗜酸性的骨和酸性染料固綠結(jié)合而成藍(lán)色，在關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的形態(tài)學(xué)研究中受到了歡迎。

　　4.Trap染色

　　Trap染色是用于檢測(cè)骨組織、骨細(xì)胞中特征物質(zhì)的染色，使破骨細(xì)胞呈紅色，背景呈綠色或藍(lán)色?？咕剖崴嵝粤姿崦?Trap)為破骨細(xì)胞的標(biāo)志酶，特異地分布于破骨細(xì)胞中，為破骨細(xì)胞所，通常作為鑒別破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物。

　　5.甲苯胺藍(lán)染色

　　軟骨基質(zhì)對(duì)甲苯胺藍(lán)的異染性，是因?yàn)檐浌腔|(zhì)的主要成分是軟骨黏蛋白、多糖物質(zhì)，而酸性硫酸根與嗜堿性染料有親和力。此法用于顯示新生骨組織鈣鹽沉積，成骨細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)，觀察軟骨退變，軟骨細(xì)胞壞死鈣化，軟骨基質(zhì)裂隙，膠原纖維增生等病理改變。染色結(jié)果：軟骨和成骨細(xì)胞呈藍(lán)紫色，背景呈淡藍(lán)色。

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