細胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)基和補充劑詳解大全

　　細胞培養(yǎng)基類型

　　一般而言，培養(yǎng)細胞需要無菌環(huán)境和支持細胞生長的營養(yǎng)供應。此外，培養(yǎng)環(huán)境的pH和溫度應該是穩(wěn)定的。在過去60年中，已經(jīng)開發(fā)出成分確定的各種類型的培養(yǎng)基，現(xiàn)在均可商購獲得。最初，用于維持哺乳動物心臟組織的收縮性，而Tyrode鹽溶液則用于原代哺乳動物細胞。后來，這些原始的配方中添加了氨基酸、維生素、脂肪酸和脂質(zhì)等營養(yǎng)素而被改良，因此，現(xiàn)代培養(yǎng)基適用于多種類型細胞的生長。精確的培養(yǎng)基配方通常通過優(yōu)化每種成分的濃度來實現(xiàn)。下面給出了各種培養(yǎng)基及其應用。

　　基本細胞培養(yǎng)基成分

　　血清

　　血清是白蛋白、生長因子和生長抑制劑的復雜混合物，可能是細胞培養(yǎng)基中最重要的成分之一。血清是胎牛血清(FBS)。其他可用的血清類型包括新生小牛血清和馬血清。血清的質(zhì)量、類型和濃度均會影響細胞的生長，因此必須根據(jù)支持細胞生長的能力來篩選血清批次。此外，還有其他一些測試來選擇血清批次，包括克隆效率、接種效率和細胞特性的保留。

　　血清還能夠增加培養(yǎng)物的緩沖能力，這對于生長緩慢的細胞或接種密度低的情況(例如細胞克隆實驗)會很重要。它還有助于防止在攪拌培養(yǎng)物或使用細胞刮刀時可能發(fā)生的機械損傷。

　　血清的另一個優(yōu)點是適用于范圍廣泛的細胞類型，盡管在生長因子方面不同培養(yǎng)物的要求不同。此外，血清能夠結合并中和毒素。然而，血清的批次之間存在差異，這使得生產(chǎn)方案的標準化變得困難。

　　使用血清還存在污染風險。從信譽良好的來源獲取血清可以最大限度地降低這些風險，因為供應大量血清的供應商會執(zhí)行一系列質(zhì)量控制測試，并提供血清分析證書。具體而言，篩選細胞培養(yǎng)血清的一個目的是檢查是否存在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和支原體。血清的熱滅活(在56 °C孵育30分鐘)可以幫助降低污染的風險，因為一些病毒可被這個過程滅活，然而，這一過程還變性某些蛋白質(zhì)和毀壞血清中的營養(yǎng)。隨著現(xiàn)代血清生產(chǎn)方法的出現(xiàn)，常規(guī)使用熱滅活血清已不再是細胞培養(yǎng)的必要條件。血清的使用還有成本問題，不僅是培養(yǎng)基配方成本，還有下游加工的成本。10% FBS補劑可提供4.8 mg/mL蛋白質(zhì)，這使得下游加工程序(例如蛋白質(zhì)純化)變得復雜。

　　血清使用指南

　　胎牛血清(FBS)已被用于制備許多生物制劑，并具有的安全記錄。但自從1986年認識了牛海綿狀腦病(BSE)，后來該病傳播到歐洲大陸，接著宣布BSE與人類克羅伊茨費爾特雅各布病的新變種之間可能存在聯(lián)系，所有這些促使人們越來越關注所有牛的安全來源。1993年，美國食品和藥物管理局(FDA)建議不要使用來自已經(jīng)診斷出BSE的國家的牛源材料。

　　血清的來源

　　ECACC僅使用來自BSE風險可忽略不計的國家的血清。來自澳大利亞、新西蘭和美國的血清具有的BSE污染風險。檢查所用血清的來源國及其BSE風險狀態(tài)至關重要。如果血清的預期用途是用于生產(chǎn)運往美國的藥用或其他產(chǎn)品，則使用具有適當質(zhì)量的血清是尤其重要的。

　　來自信譽良好的供應商的血清應該已經(jīng)過各種質(zhì)量控制測試，這些測試會在產(chǎn)品信息表中列出。大多數(shù)血清產(chǎn)品都經(jīng)過細胞培養(yǎng)測試，包括促生長、克隆效率和接種效率測試。

　　對血清進行的標準測試通常包括確定以下內(nèi)容是否存在/或存在水平的測試：無菌性、病毒污染、支原體污染、內(nèi)毒素、血紅蛋白、總蛋白、免疫球蛋白、激素測試、pH(在室溫下)和摩爾滲透壓濃度。

　　無機鹽類

　　培養(yǎng)基中含有無機鹽是為了提供幾種功能。鹽主要是用鈉、鉀和鈣離子建立和保持細胞的滲透平衡和調(diào)節(jié)膜電位。所有這些都是細胞基質(zhì)中為了細胞附著所必需的，而且也是必要的酶輔助因子。

　　緩沖系統(tǒng)

　　大多數(shù)細胞需要7.2-7.4的pH條件，而且，通過密切控制pH對于優(yōu)化培養(yǎng)條件十分必要。這個優(yōu)化條件有幾個較大的例外，成纖維細胞喜歡較高的pH(7.4-7.7)，而連續(xù)轉化的細胞系則需要更加酸性的條件。

　　在培養(yǎng)新的培養(yǎng)物時，接種細胞后應立即調(diào)節(jié)pH值，這點非常重要，而且一般用兩種緩沖系統(tǒng)中的一種實現(xiàn)：(i)“天然"緩沖系統(tǒng)，其中氣態(tài)CO2與培養(yǎng)基的CO3/ HCO3平衡;(ii)使用HEPES兩性離子進行化學緩沖。

　　使用天然碳酸氫鹽/CO2緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)物，需要在CO2培養(yǎng)箱中進行，其中的空氣應含有5-10%的CO2。碳酸氫鹽/CO2成本低，無毒，并且還為細胞提供其他化學營養(yǎng)。

　　HEPES在7.2-7.4的pH范圍內(nèi)具有優(yōu)異的緩沖能力，但是相對昂貴，并且在較高濃度(高于~100 nM)下對某些細胞類型有毒。HEPES緩沖的培養(yǎng)物不需要受控的空氣環(huán)境。

　　大多數(shù)商業(yè)培養(yǎng)基含有酚紅作為pH指示劑，因此培養(yǎng)基的pH狀態(tài)始終有顏色指示。通常，當顏色變?yōu)辄S色(酸性)或紫色(堿性)時，應更換/補充培養(yǎng)基。

　　碳水化合物

　　這種能量的主要來源通常是糖類形式的碳水化合物。所使用的主要糖類是葡萄糖和半乳糖，但有些培養(yǎng)基則含有麥芽糖或果糖。糖的濃度從基礎培養(yǎng)基中的1 g/L至一些更復雜培養(yǎng)基中的4.5 g/L不等。含有較高濃度糖的培養(yǎng)基能夠支持更廣泛細胞類型的生長。有些培養(yǎng)基的配方中含有丙酮酸鹽，作為替代能量源。

　　氨基酸類

　　氨基酸是蛋白質(zhì)的基本成分。必須在培養(yǎng)基中添加“必需"氨基酸，因為細胞本身無法合成這些氨基酸。培養(yǎng)基中氨基酸的濃度將決定可以達到的最大細胞密度 — 一旦耗盡，細胞將不再能增殖。

　　必需氨基酸對細胞培養(yǎng)極為重要。在液體培養(yǎng)基或原液中，谷氨x胺會迅速降解。要想達到最佳細胞性能，一般在使用之前才給培養(yǎng)基補充谷氨x胺。有些培養(yǎng)基配方包含更穩(wěn)定的L-谷氨酰，且不需要補充。

　　向培養(yǎng)基添加非必需氨基酸不僅可以刺激細胞生長，還可以延長培養(yǎng)基中細胞的活力。

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