多重熒光免疫組化--TSA技術

　　基于酪胺信號放大(TSA)技術，多重熒光免疫組化(mIHC)利用抗原抗體反應對樣本中多種蛋白標志物進行染色標記，米徠迪生物,實現(xiàn)在同一組織切片上多個靶標蛋白共同染色(最多可實現(xiàn)數(shù)十種蛋白的共染色)，從而通過熒光圖像分析挖掘組織微環(huán)境中的復雜信息，如定量分析、共表達確定細胞分型、空間關系分析等等。

　　一、技術原理

　　酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。熒光標記的酪胺分子在H2O2環(huán)境下被二抗標記的HRP催化激活，產(chǎn)生大量的酶促反應，使熒光素在抗原-抗體結合部位與組織周圍的蛋白殘基結合，形成大量的熒光素沉積，實現(xiàn)信號放大。

　　TSA技術原理是熒光染料與抗原直接結合，通過熱處理或微波處理可洗脫一抗和二抗并同時保留與組織抗原共價結合的熒光素。米徠迪生物，因此可以通過使用不同的偶聯(lián)染料多次循環(huán)實驗對多種蛋白抗原進行熒光標記，實現(xiàn)一張組織切片上多個蛋白的共染色。

　　二、優(yōu)勢

　?、賂SA技術可使熒光放大信號大幅增強，大約是普通熒光的3~10倍。

　?、谝豢箍贵w的種屬來源不限。

　　普通熒光免疫組化共染的不同靶標要求一抗抗體是不同的種屬來源，而TSA技術每一輪染色后可以把上一輪的一抗和二抗洗掉，對后一輪染色無影響，因此同一種屬來源的一抗并不影響實驗結果。

　?、蹖嶒炦^程中無需嚴格避光，因熒光素穩(wěn)定不容易淬滅，米徠迪生物，實驗操作過程中即使沒有避光也不影響實驗結果，且染色后的玻片可以保存數(shù)月不淬滅，仍可以重新掃描。

　　三、實驗步驟

　　1.脫蠟和水化

　　將切片組織依次放入烘箱內(nèi)烤片1h→二jia 苯Ⅰ15min→二jia苯Ⅱ15min→無水乙醇Ⅰ5min→無水乙醇Ⅱ

　　2.抗原修復

　　根據(jù)一抗選擇合適的修復液(酸性的檸檬酸鈉緩沖液或堿性的Tris-EDTA緩沖液)，米徠迪生物，將切片組織浸沒于修復液中加熱至沸騰，中低火維持20 min，自然冷卻至室溫。

　　3.阻斷過氧化物酶

　　用PBS洗滌三次，每次4 min。切片組織放入3%過氧化氫水溶液中，孵育15 min。用PBS洗滌三次，每次4 min。

　　4.封閉

　　在組織周圍畫阻水圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)加入血清封閉 10min。

　　5.一抗孵育

　　輕輕甩去封閉液，在圈內(nèi)滴加一抗工作液覆蓋組織，米徠迪生物，于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜或者 37℃ 1~2h。

　　6.二抗孵育

　　用PBS洗滌三次，每次4 min。圈內(nèi)加入配置好的HRP標記二抗(與一抗相應種屬)，避光室溫孵育30min。

　　7. TSA熒光染料反應

　　用PBS洗滌三次，每次4 min。古朵生物，圈內(nèi)滴加TSA工作液孵育10min。PBS洗滌三次，每次4 min。

　　8、重復 2-7 步驟(選擇對應的TSA熒光染料)

　　9、DAPI 細胞核染色

　　PBS洗滌三次，每次4 min。米徠迪生物，圈內(nèi)滴加DAPI抗淬滅染液孵育10min。

　　10、 封片

　　PBS洗滌三次，每次4 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

　　11、使用熒光掃描儀對玻片組織進行全景掃描

　　四、注意事項

　?、偃玖铣浞秩芙饣靹?，有的試劑盒是有機溶性，如有沉淀，一定要先過濾。

　?、趯嶒炦^程中避免切片干燥，并注意避光。米徠迪生物，

　　③選擇特異性高的一抗抗體。

　?、鼙磉_高的一抗搭配弱光，表達低的搭配強光。米徠迪生物，

　?、輰嶒炃白龊梅桨冈O計，確定好染色順序、修復條件，以及每個抗體搭配的熒光染料。

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